基于自鎖式適體探針的級聯擴增策略的生物分子檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種核酸檢測技術領域，具體涉及一種基于自鎖式適體探針的級聯擴 增策略用于蛋白質和小分子物質的高靈敏、高特異性的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 適體是一類人工合成的、短的單鏈寡核苷酸序列，常被用于生物傳感、診斷和治療 等領域。適體通常具有特定且緊湊的二級或三級結構，對其相應的目標物具有高的親和力 和選擇性。與抗體或抗體片段相比，適體具有穩定、易于合成和修飾、目標物廣泛的特點，其 目標物包括蛋白、小分子、金屬離子甚至細胞等。因此，適體已被廣泛用于分子探針的構建。
[0003] 以適體為基礎的分子探針主要包括兩部分:適體序列和信號序列。適體序列能夠 折疊成緊湊的二級或三級結構，同時特異性識別其目標物。一旦適體序列與目標物結合，信 號序列即可被釋放產生信號。然而，在實際適體傳感體系中，適體探針通常是過量的。理論 計算顯示，適體在未結合目標物時，亦可發生構象轉變，從而產生干擾信號，影響檢測的準 確性。為了解決這個問題，一種方法是將適體探針固定在一個異相表面上，通過洗滌將多余 的適體探針洗去。這種方法能夠有效避免干擾信號的產生，但是異相界面的引入會導致線 性范圍受限及目標物、探針的結合效率降低的缺陷。為了避免這些問題，實現基于適體的均 相檢測，另一種方法就是引入一段短的阻滯DNA分子，使其與適體序列的活性部分雜交，形 成一個阻滯鏈封閉的適體探針，從而抑制適體的非特異性折疊。然而，由于該阻滯鏈較短 (12_15nt)，雙鏈結構的不穩定性會導致阻滯鏈泄露(從適體探針上脫落），進而導致干擾信 號的產生。因此，為了進一步減少干擾信號、提高檢測準確性，構建一個新的、更加穩定的適 體探針是十分重要的。
【發明內容】
[0004] 本發明為解決上述現有技術的不足，提供一種檢測蛋白質和生物小分子物質的自 鎖式適體探針及基于自鎖式適體探針的級聯擴增策略用于蛋白質和小分子物質的高靈敏、 高特異性的檢測方法。
[0005] 本發明采用的技術方案如下：
[0006] -種用來檢測蛋白質和生物小分子的自鎖式適體探針，該探針至少包括兩個部 分:對目標物具有特異性識別的3'端的適體序列和5'端的信號轉導序列，所述5'端的信號 轉導序列與部分適體序列雜交，形成5'端莖-環結構，所述5'端的信號轉導序列包含切刻內 切酶的識別位點，該切刻內切酶的識別位點位于5 '端的信號轉導序列的3 '端。
[0007]該設計使得自鎖式適體探針在無目標物時處于自鎖狀態，從而使適體序列在無目 標物時不發生折疊。自鎖式適體探針分子通過自身回折，使5'端的信號轉導序列與部分適 體序列中互補的堿基對相遇，形成氫鍵結合而成的，稱為發夾結構(或莖-環結構）。
[0008]所述3'端的適體序列是用來結合目標物，它是通過指數富集的配體系統進化技術 (簡稱SELEX技術)從人工體外合成的隨機寡核苷酸序列庫中反復篩選得到的能以高的親和 力和特異性與目標物結合的一段寡核苷酸序列。
[0009] 本發明設計的自鎖式適體探針可以用來檢測各種生物蛋白分子和生物小分子，所 述生物蛋白分子為血小板源性生長因子BB(PDGF-BB)，生物小分子為腺苷。通過改變適體序 列和設計探針，該方法也可被用于其它生物分子的檢測。
[0010] 優選的，當適體序列5'端部的堿基不適合與信號轉導序列3'端部形成氫鍵時，該 探針還包括用來連接適體序列和信號轉導序列的連接序列，所述連接序列用來參與形成5' 端莖-環結構，保證信號轉導序列與部分適體序列可以雜交形成莖-環結構。
[0011] 優選的，該探針在3 '端的適體序列的3 '端部還連接配合序列，所述配合序列的堿 基個數為1~5個，目的是使3'端適體序列順利打開5'端的發夾結構。
[0012] 本發明還提供一種上述探針在檢測蛋白質和生物小分子物質含量中的應用。
[0013] 基于自鎖式適體探針的級聯擴增策略檢測蛋白質或生物小分子物質的方法，包括 以下步驟：
[0014] (1)鏈取代擴增反應:首先將含有目標物的待檢測物與自鎖式適體探針結合，折疊 成三向螺旋結構，打開5'端信號轉導序列與部分3'端適體序列形成的莖-環結構;上述體系 在DNA聚合酶、切刻內切酶和dNTP存在時，3 '端的三向螺旋結構作為引物觸發SDA反應，產生 大量的引物序列1;
[0015] (2)雙重指數型擴增滾環擴增:將步驟(1)中引物序列1與模板1雜交，在DNA聚合酶 的作用下觸發第一級指數型RCA擴增反應，產生大量的引物序列2;引物序列2與模板2雜交， 在DNA聚合酶的作用下觸發第二級指數型RCA擴增反應，產生大量的G-四倍體序列，插入熒 光分子后，產生熒光信號，通過檢測到的熒光信號對蛋白質或生物小分子物質進行定量測 定。
[0016] 具體步驟如下：引物序列1與模板1雜交，在DNA聚合酶的作用下觸發線性RCA反應， 產生一條長的單鏈DNA產物;該產物能夠與體系中過量的模板1雜交，暴露出切刻內切酶的 識別位點，從而被切刻酶內切酶切刻，產生大量的引物序列2;而游離的引物1/模板1復合物 進行下一個聚合、切刻循環，完成第一級指數型RCA擴增反應;最后，引物序列2與模板2雜 交，在DNA聚合酶的作用下觸發第二級指數型RCA擴增反應，產生大量的G-四倍體序列，插入 熒光分子后，產生熒光信號通過檢測到的熒光信號對蛋白質或生物小分子物質進行定量測 定。
[0017] 若是待檢測物中不含有目標物時，不發生鏈取代擴增反應和雙重指數型擴增滾環 擴增反應，插入熒光分子后則不產生熒光信號。
[0018] 具體包括以下步驟：
[0019] ⑴綁定誘導的鏈取代擴增(SDA)
[0020] 將含有目標物的待檢測物和上述自鎖式適體探針進行第一次孵育反應，孵育之后 加入具有鏈置換活性的DNA聚合酶、切刻內切酶、dNTPs、緩沖液和水進行第二次孵育反應， 最后通過加熱使SDA反應終止;具體反應步驟如下：
[0021] 將含有目標物的待檢測物和自鎖式適體探針(50ηΜ，5μυ在37°C下孵育lh;隨后加 入0.4yL KF聚合酶、0.2yL Nt.BbvCI、4yL 2mM dNTPs、2yL Cutsmart和3.4yL水，37°C下孵 育2.5h;最后通過80 °C加熱1 Omin使SDA反應終止。
[0022] (2)連接反應
[0023] 向步驟（1)中的擴增產物中加入模板1，T4DNA連接酶、T4DNA連接酶緩沖液和水，進 行模板1環狀連接反應;具體反應步驟如下：
[0024] 向上述20yL SDA擴增產物中加入1.4yL ΙΟμΜ模板l、0.3yL T4 DNA連接酶、3.0yL T4 DNA連接酶緩沖液和5.3yL水，37 °C下反應40min。
[0025] (3)雙重指數型滾環擴增(DE-RCA)
[0026]取步驟(2)中的連接產物，加入模板2、DNA聚合酶、切刻內切酶、緩沖液和dNTPs和 水進行擴增反應，最后通過加熱使DE-RCA反應終止;具體反應步驟如下：
[0027] 取上述30yL連接反應產物，加入1.4yL ΙΟμΜ模板2、0.4yL phi 29DNA聚合酶、0.4μ LNt · BbvCI、5yL Cutsmart、10yL dNTPs和22 · 8yL水，37°C下反應5h;該步反應通過80°C加熱 lOmin終止。
[0028] (4)熒光檢測
[0029] 取步驟(3)中的擴增產物，加入N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)進行反應，最后采用熒 光儀進行熒光測定;具體反應步驟如下：
[0030] 取上述DE-RCA產物，加入5yL 2mM KC1 和5yL 0.08mM NMM，37°C 下反應40min。最后 用Hitachi F-7000熒光儀進行熒光測定，激發波長選擇399nm，發射波長的收集范圍選擇 550~680nm，最終選擇612nm處的熒光強度考察方法的靈敏度。
[0031]優選的，所述5'端的信號轉導序列如SEQ ID N〇:l所示。
[0032] 優選的，所述5'端的信號轉導序列為5'-GCT GTG GAT ACT GCT GAG GCC A-3'，如 SEQ ID No :1所示。
[0033] 根據檢測的目標物不同，更換相應的3'端適體序列和連接序列。當目標物為與癌 癥相關的血小板源生長因子BB(H)GF-BB)時，優選的，PDGF-BB的適體序列為5'-CA GGC TAC GGC ACG TAG AGC ATC ACC ATG ATC CTG-3'，如SEQ ID 叱：2所示，連接序列為5'-〇^-3'， 配合序列為5'-TG-3'。當目標物為腺苷時，優選的，腺苷的適體序列為5'-AC CTG GGG GAG TAT TGC GGA GGA AGG T-3'，如SEQ ID No:3所示，連接序列為5'-CCACAG-3'，配合序列為 5'-CTGT-3'。
[0034] 優選的，所述切刻內切酶為切刻酶Et. BbvCI，相應的切刻酶Et. BbvCI的識別位點 序列為5'_GCT GAG G-3'。
[0035] 優選的，所述模板1的序列形成環狀后包括一段引物序列1的互補序列和和兩個引 物序列2的互補序列，各個引物序列2的互補序列之間、引物序列2的互補序列與引物序列1 的互補序列之間均通過切刻內切酶識別位點序列相連接。優選為5 ' -TAC TGC TGA GGG AGT TGA GTG CTG AGG GAG TTG AGT GCT GAG GCT GTG GA-3'，如SEQ ID No:4所示，其中劃線 序列為切刻內切酶的識別位點。其中，所述引物序列1為上述SDA反應的產物，所述引物序列 2是上述第一級指數型RCA擴增反應的產物。
[0036] 優選的，所述模板2的序列形成環狀后包括一段引物序列2的互補序列和兩個G-四 倍體序列的互補序列，各個G-四倍體序列互補序列之間、G-四倍體序列的互補序列與引物 序列2的互補序列之間均通過切刻內切酶識別位點序列相連接。優選為5 ' -AGT GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA