一種獲得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼全序列的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物信息和分子生物學領域，具體說是一種獲得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋 白基因編碼區全序列的方法。
【背景技術】
[0002] 細胞凋亡，也稱為程序性細胞死亡，是由生物體中多種基因精確調控的一種細胞 死亡方式，在生長、發育、免疫、穩態維系等諸多生物學過程中起重要作用。凋亡抑制蛋白是 重要的凋亡調控蛋白，廣泛存在于多種生物體中，在哺乳動物尤其是人類中研究較為深入。 凋亡抑制蛋白家族成員除可對生物體中多種生物學過程中細胞凋亡起到抑制作用外，也參 與細胞周期、免疫反應等過程的調控。在人類中，由于凋亡抑制蛋白過量表達于癌癥細胞 中，因此在癌癥機制、分子靶向藥物研制及治療等方面成為一個研究熱點。
[0003] 櫛孔扇貝是我國重要養殖貝類，但是其基礎研究相對薄弱，目前尚無凋亡抑制蛋 白基因序列的研究報道。通過傳統的基因末端擴增法獲取櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因序 列，存在一定的難度，主要表現為：1)從大量轉錄組序列中篩查目標基因片段費時費力；2) 缺乏櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼片段，無法進行后續的引物設計；3)通過傳統的借助 商業試劑盒進行基因末端擴增法獲得基因序列效率較低，費用較高。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種獲得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼全序列的方法。
[0005] 為實現上述目的本發明采用的技術方案為：
[0006] -種獲得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼全序列的方法，從NCBI獲得櫛孔扇貝 轉錄組表達序列，對獲得的序列進行拼接組裝處理，處理后獲得局部比對數據庫，利用已知 現有生物報道的凋亡抑制蛋白序列與上述局部比對數據庫進行比對獲得櫛孔扇貝凋亡抑 制蛋白基因編碼片段；
[0007] 利用上述獲得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼片段根據基因片段設計擴增引物 YF1和YF2,獲得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼區序列；
[0008] 根據獲得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼區序列的5'端和3'端，設計相應的擴 增引物，分別進行凋亡抑制蛋白基因編碼序列的5'端和3'端延伸擴增，擴增后利用重疊片 段法進行連接，獲得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼區全長序列。
[0009] 所述弓丨物YF1序列為' AGGGCTGGCCGAAATCAGATAGA'，弓丨物YF2序列 為 ' TGGAAAATGGCGGTAATGCTCAA'。
[0010] 所述擴增櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼區序列的5'端序列的引物K5R1序列 為 ' CGTGAAGCACACCACCACAGTA'，引物 K5R2 序列為 ' TGAACTCTGTCTTTTTCCCCTA'。
[0011] 所述擴增櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼區序列的3'端序列的引物K3F1序列 為 ' TGTCAACAAACACCAAATGTCCCAG'，引物 K3F2 序列為 ' TTCACACAATCGACAGTTAGGGAAC'。
[0012] 所述凋亡抑制蛋白基因編碼序列的5'端和3'端延伸擴增是以櫛孔扇貝cDNA序 列為模板，進行巢式PCR擴增。
[0013] 本發明具有以下優點：
[0014] 1.本發明針對當前已有大量公開發布的櫛孔扇貝表達序列可供免費檢索，獲得利 用已公開序列建立基因搜索數據庫，降低了獲得基因序列的難度。
[0015] 2.本發明提供的方法中生物信息分析過程對計算系統要求低，結果準確，提高了 后續引物設計的可靠性。
[0016] 3.本發明結合生物信息分析和傳統分子生物學實驗手段，能簡單，高效，低成本地 獲得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼區序列。
[0017] 4.本發明提供的方法能快速經濟獲得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白相關基因編碼序列。 數據庫構建步驟簡單快速，對運算系統要求低，可完全本地化操作；后續擴增測序利用常規 分子生物實驗方法和試劑，簡單易行，結果可靠。
【附圖說明】
[0018] 圖la、lb、lc、ld為本發明實施例提供的采用本發明方法獲得的櫛孔扇貝凋亡抑 制蛋白基因1編碼全序列圖、結構域歸類和結構域功能注釋，全序列全長為756bp。
[0019] 圖2a、2b、2c、2d為本發明實施例提供的采用本發明方法獲得的櫛孔扇貝凋亡抑 制蛋白基因2編碼全序列、結構域歸類和結構域功能注釋，全序列全長為1071bp。
[0020] 圖3a、3b、3c、3d為本發明實施例提供的采用本發明方法獲得的的櫛孔扇貝凋亡 抑制蛋白基因3編碼全序列、結構域歸類和結構域功能注釋，全序列全長為729bp。
【具體實施方式】
[0021] 下面以獲得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因的編碼序列為實例，對本發明作進一步的 闡述。
[0022] 實施例1
[0023] 櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因 1編碼全序列的獲得。
[0024] 1)從 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)中獲得柿孔扇貝表達序列，計 1，222, 461 條。
[0025] 2)去除掉小于100bp和包含不確定堿基' Ν'的序列后，將剩余的1，058, 961條序 列；利用CAP3對這些序列進行拼接組裝，命令為' CAP3ZK_RAW. fasta-o 50-ρ 95'，共獲得 contig 序列 79, 617 條，singlet 序列 571，539 條，即總共獲得 UniGene 序列 651，156 條。
[0026] 3)將步驟2)獲得的UniGene序列通過運行BLAST工具包中的F0RMATDB命令，獲 得櫛孔扇貝UniGene局部比對數據庫，具體運行參數為'F0RMATDB-i UniGene-p F'。
[0027] 4)利用現有牡蠣已公布48條凋亡抑制蛋白序列，借助BLAST工具包中 的BLASTALL命令和上述獲得的UniGene局部比對數據庫進行比對，具體命令參數 為 ' BLASTALL-i oyster48. fasta-d UniGene-p tBLASTn-e le 5-〇 ΖΚ· IAP. fragment，。而 后將獲得序列中的E值低于le 且對牡蠣凋亡抑制蛋白基因編碼序列覆蓋率大于50%的 序列初步確定為櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼片段。
[0028] 5)根據上述確定的櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼片段設計擴增 引物 YF1 和 YF2，其中 YF1 序列為 'AGGGCTGGCCGAAATCAGATAGA'，YF2 序列 為 ' TGGAAAATGGCGGTAATGCTCAA' ；擴增后測序獲得序列 ' AGGGCTGGCCGAAATCAGATAGATTAAAA TCGGAACTAATTTTGGATGGGTTTTTTTACCTAGGGGAAAAAGACAGAGTTCAATGTGCTTACTGTGGTGGTGTGCT TCACGGTTTTGAAGAAGATGATAATGTACACATTGAGCATTACCGCCATTTTCCA'，利用 EMBL 的 INTERPRO 程序預測序列結構域并進行家族歸類，利用NCBI的BLAST程序進行序列結構域和功能注 釋，發現序列含有凋亡抑制蛋白的BIR特征結構域，并可歸類為BIR超家族，因此可確定獲 得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼片段。
[0029] 6)根據上述獲得的櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼區序列設計5'端擴 增引物 K5R1 和 K5R2，其中 K5R1 序列為 'CGTGAAGCACACCACCACAGTA'，K5R2 序列 為' TGAACTCTGTCTTTTTCCCCTA'，以櫛孔扇貝cDNA序列為模板，進行巢式PCR擴增，擴增體系 和條件為，cDNA模板50ng，引物分別為5pmol，Taq酶1U，95°C加熱lOmin后，進行30個熱 循環，其中每個循環包括95°C加熱30s，60°C加熱40s，72°C加熱30s，最后72°C加熱lOmin。 第一輪擴增產物稀釋10倍后，以上述相同條件進行第二輪擴增。獲得櫛孔扇貝凋亡抑制蛋 白基因編碼區 5' 端序列 'ATGTGTGGTATAACTGGGCTATGTGTTAATTGTAAAAAGGTTACATCAGGTATGC ATCAAGTTCCAGGAAGGGATATTGTCCCTCCGCGGCCCATAGAAAGGTACAGACACCTCCGCGACACAGACACCAGA ACAAGAACGTACAAGGGCTGGTTGAAATCAGATAAATTAAAATCGGAACTAATTTTGGATGGGTTTTTTTACCTAGG GGAAAAAGACAGAGTTCAATGTGCTTACTGTGGTGGTGTGCTTCACG' ；
[0030] 7)根據獲得的櫛孔扇貝凋亡抑制蛋白基因編碼區序列設計3'端擴增 引物 K3F1 和 K3F2，其中 K3F1 序列為 'TGTCAACAAACACCAAATGTCCCAG'，K3F2 序列 為' TTCACACAATCGACAGTTAGGGAAC'以櫛孔扇貝cDNA序列為模板，進行巢式PCR擴增，擴增 體系和條件為，cDNA模板50ng，引物分別為5pmol，Taq酶1U，95°C加熱lOmin后，進行30 個熱循環，其中每個循環包括95°C加熱30s，6(TC加熱40s，72°C加熱30s，最后72°C加熱 lOmin。第一輪擴增產物稀釋10倍后，以上述相同條件進行第二輪擴增。獲得櫛孔扇貝凋 亡抑制蛋白基因編碼區 3' 端序列 ' CTTACTGTGGTGGTGTGCTTCACGGTTTTGAAGAAGATGATAATGTA CACATTGAG