一種納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備方法及其在降解氯代酚中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于應用微生物與環境工程技術領域，涉及一種納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備方法及其在降解氯代酚中的應用。
【背景技術】
[0002]氯代酚類化合物是合成有毒有機物中的一大類，對許多微生物具有抑制毒害作用，在環境中難以被微生物分解，屬于難降解有機物。此類化合物是美國環保局(EPA)重點控制的129種優先污染物(pr1rity pollut1ns)之一，我國也將其列在重點污染物的黑名單之中。氯代酚類化合物在化工、農藥、醫藥、造紙、防腐劑等工業中得到廣泛應用，同時也導致了嚴重的環境問題。其中2-氯代酚、4-氯代酚和2，3_ 二氯代酚是較為常見的污染物。它們常作為木材的防腐劑、除草劑、殺菌劑、溶劑以及熱交換過程中的工業生產廢棄物而釋放到環境中，對水體和土壤造成了很大的危害。對于有毒有機物的污染控制，生物處理技術由于成本較低，降解徹底等特點而受到人們的青睞。由于氯代酚類化合物具有殺菌作用，它們更難于被生物降解，因此氯代酚的微生物降解收到重視。
[0003]國內外已有許多氯代酚類化合物微生物降解的研究報道。但是由于氯代酚對微生物的毒性，使用游離的微生物細胞降解氯代酚存在降解效率不高，生物催化劑失活的缺陷。
[0004]相比較游離細胞，使用固定化的細胞降解氯代酚可以提高生物催化劑的耐受性，并且固定化細胞可以重復利用，可以提高生物處理的經濟性。進而，納米磁性顆粒可以增加固定化顆粒的比表面積，更有利于生物催化劑接觸底物，因此采用納米磁性顆粒固定化細胞，可以解決常規固定化細胞存在的物質傳輸障礙的問題，具有較廣闊的應用前景。
【發明內容】
[0005]為了解決上述現有技術中采用游離的微生物細胞降解氯代酚存在降解效率不高、生物催化劑失活等問題，本發明研究了一種納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備方法。
[0006]本發明還提供了所述得到的納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚中的應用。
[0007]本發明技術方案如下:
一種納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備方法，步驟包括:
I)制備苯胺降解菌細胞懸液:將苯胺降解菌接種于M65培養基中，28°(:恒溫培養24h，然后4000 r/min離心1min，收集菌絲細胞，再用pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，分散于水中，制得苯胺降解菌細胞懸液，備用；
2 )納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備:從下述a )和b )中任選一種方法:a)將瓊脂糖或卡拉膠加熱至完全溶化，50°C保溫加入步驟I)的苯胺降解菌細胞懸液和Fe3(k納米磁性顆粒，混合均勾，降溫至4°C，得固體混合物，將該混合物切割為3mmX 3mm的均勻顆粒，然后將顆粒置于質量分數為3%氯化鉀水溶液中固定2h，制得納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌；
步驟a)中，所述瓊脂糖或卡拉膠與苯胺降解菌細胞懸液質量比為3:1。
[0008]b)將質量百分數為1%的結冷膠水溶液或質量百分數為2%的海藻酸鈉水溶液與步驟I)的苯胺降解菌細胞懸液按體積比1:1混合，并加入Fe3O4納米磁性顆粒，混合均勻，然后均勻滴加至質量分數為2%的氯化鈣水溶液中，固定2h，生成球狀顆粒，制得納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌；
步驟I)中，所述苯胺降解菌細胞懸液OD 600=300。
[0009]步驟I)中，所述培養基為M65培養基，其成分包含4g/L的酵母粉、4g/L的葡萄糖和10 g/L的麥芽提取物，培養基pH 7.2。
[00?0] 步驟2)中，所述Fe304納米磁性顆粒加入濃度為3?12 g/L，優選9g/L。
[0011 ] 所述的苯胺降解菌為玫瑰色紅球菌DSM 6263(Rhodococcus rhodochrousDSM6263)購自德國菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)
本發明方法制備得到的納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚中的應用，所述氯代酚為2-氯代酚、4-氯代酚或2，3-二氯代酚。
[0012]所述納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚中的應用，方法為:
I)制備納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌；
2)向氯代酸樣品中加入步驟I)制備的納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌，于180 rpm、28°C搖床中，反應21?24h，至氯代酚充分降解。
[0013]上述應用，步驟2)中，所述氯代酚樣品為0.25mM的氯代酚一磷酸緩沖液；
上述應用，步驟2)中，所述納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌加入量為濕重14g/L;
上述應用中，納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌在降解氯代酚后可回收，回收處理方式為:通過磁鐵吸附回收納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌，將其放置于M65培養基中活化30min，取出后再用去尚子水洗滌2遍。
[0014]上述應用中，納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌可至少回收重復使用7批次。
[0015]本發明的有益效果為:
采用納米磁性顆粒固定化高效苯胺降解菌，固定化的細胞可以高效的降解2-氯代酚，4-氯代酚和2，3_ 二氯代酚。降解濃度高，速度快。同時由于固定化材質中含有磁性顆粒，可以方便的用外部磁場從水體中回收固定化細胞，極大的方便的生物催化劑的回收和再利用，有利于降低生物處理成本，在氯代酚廢水處理過程中具有巨大的應用潛力。
【附圖說明】
[0016]圖1為不同材質固定化的細胞對2-氯代酚的降解情況；
圖2為不同材質固定化的細胞對4-氯代酚的降解情況；
圖3為不同材質固定化的細胞對2，3_ 二氯代酚的降解情況；
圖4為添加不同濃度Fe3O4磁性顆粒的固定化細胞對2-氯代酚的降解情況；
圖5為重復利用磁性固定化的細胞對2-氯代酚的降解情況。
【具體實施方式】
[0017]下面將通過實施例對本發明作進一步的描述，這些描述并不是對本
【發明內容】
作進一步的限定。本領域的技術人員應理解，對本
【發明內容】
所作的等同替換，或相應的改進，仍屬于本發明的保護范圍之內。
[0018]實施例1
一種納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備方法，步驟包括:
1)制備苯胺降解菌細胞懸液:將苯胺降解菌接種于成分包含4g/L的酵母粉、4g/L的葡萄糖和1g/!的麥芽提取物、PH 7.2的1165培養基中，28°(:恒溫培養2411，然后4000 r/min離心1min，收集菌絲細胞，再用pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，分散于水中，制得苯胺降解困細胞懸液，OD 600=300，備用；
2)納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備:將卡拉膠加熱至完全溶化，50°C保溫并按質量比為3:1加入步驟I)的苯胺降解菌細胞懸液和濃度為9g/L的Fe3O4納米磁性顆粒，混合均勻，降溫至4°C，得固體混合物，將該混合物切割為尺寸3_X3mm的均勻的顆粒，然后將顆粒置于質量分數為3%氯化鉀水溶液中固定2h，制得納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌。
[0019]實施例1苯胺降解菌為玫瑰色紅球菌DSM 6263(Rhodococcus rhodochrousDSM6263)購自德國菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，下同。
[0020]實施例2
一種納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備方法，步驟包括:
1)制備苯胺降解菌細胞懸液:同實施例1;
2)納米磁性顆粒固定化苯胺降解菌的制備:將瓊脂糖加熱至完全溶化，50°C保溫并按質量比為3:1加入步驟I)的苯胺降解菌細胞懸液和濃度為6g/L的Fe3O4