一種豬睪丸間質祖細胞的長期培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于干細胞技術領域，更具體地，本發明涉及一種豬睪丸間質祖細胞的長 期培養方法，包括體外分離、檢測與分化的方法。
【背景技術】
[0002] 在雄性動物睪丸組織中，眾所周知在生精小管內側壁存在著源源不斷產生的精子 的一類保持自身數量恒定的精原干細胞;然而在生精小管外側壁還存在另一類維持增殖與 分化平衡的干細胞，它是睪丸間質干細胞（leydig stem cells，SLCs)，SLCs在經歷睪丸間 質祖細胞（progenitor leydig cells，PLCs)、未成熟睪丸間質細胞（immature leydig cells，ILCs )等階段后，形成具有分泌睪酮功能的成熟睪丸間質細胞（adult leydig cel 1 s，ALCs)，雄性動物體內95%左右的睪酮是由ALCs分泌，對于維持雄性動物體內睪酮水 平的動態平衡具有重要作用。
[0003] 雄激素睪酮是雄性動物體內最為重要的激素之一。幼年時期對于性器官和副性器 官的生長和發育發揮重要作用，而且對肌肉和骨骼的發育也起到重要作用;雄性動物在青 春期出現第二性征，進入成年期后對維持性功能、正常的精子生成起決定性作用。男性睪酮 缺乏綜合癥是目前影響男性健康與生育能力的主要原因。
[0004] 然而關于SLCs生物學數據并不多，主要是來自嚙齒動物的研究，而其他物種的情 況還不清楚。研究發現SLCs特異性高水平表達TOGFRa和白血病抑制因子受體蛋白（LIFR)， 但不表達LHR和類固醇代謝相關的酶(〇￥?11 &1、〇￥?17&1、3七41?和30-批〇)等基因。其中？〇6卩 因子廣泛存在生精小管的管周的細胞中，對于促進SLCs的分化有重要的作用。PLCs是由 SLCs分化而來的一類中間階段的干細胞，具有和SLCs類似形態特征，成紡錘狀，但是基因表 達發生了很大的改變，主要表現在出現了類固醇代謝相關酶(CYPllal、CYP17al和StAR)和 少量的的LHR表達，但并沒有3f3-HSD的表達，同時它還保留SLCs的標記LIFR和PDGFRa的表 達，表現出分裂能力強的特征。
[0005] 睪酮合成過程相當復雜，膽固醇作為原料，在一系列的酶(〇￥?1141工￥?1741、30-!〇和170-!^〇)及蛋白（31?-81、3七41?、？81〇的作用下轉變成為睪酮。而（3?-^1^77、？?41^、 AhR、NFkB、CREB、GATA-4、花生四烯酸、磷酸酯酶、TGF-α、GRTH、SREBP等）等轉錄因子通過調 控靶基因而影響相應的酶及蛋白的表達水平來調控睪酮合成。下丘腦-垂體-性腺 (hypothalamic-pituitary-testicular ,ΗΡΤ)調節系統所分泌的物質（LH、FSH、PRL、GnRH、 E2、0T、VP、鈣離子和堿性成纖維細胞生長因子等)也具有調控間質細胞的睪酮分泌的活動。 膽固醇作為原料在StAR的作用下，從ALCs的線料體外膜轉運到膜內；接著，被側鏈裂解酶細 胞色素 CYP11A1催化而變成孕烯醇酮;然后，孕烯醇酮在17-羥化酶/17-20裂解酶(CYP17A1) 作用下變成17a-羥孕酮；隨后，被17-羥留脫氫酶（17-HSD)催化而變為雄烯二酮;最后，被 存在于ALCs的光面內質網上邪-HSD催化而變成睪酮。
[0006] 豬的器官和人類的器官最為接近，所以豬也是人類醫學研究理想的動物模型和異 種器官移植的理想材料，同時豬做為畜牧業最重要的一種飼養動物，關系到國計民生。提高 種公豬的繁育能力，一直是豬育種研究的重點，雄激素睪酮與雄性動物的生育能力息息相 關，所以豬睪丸間質干/祖細胞研究在豬育種研究具有重要的意義，同時也是人類再生醫學 良好的模型，意義重大。
【發明內容】
[0007] 基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種豬PLCs的體外分離增 殖培養基、一種豬PLCs的分化培養基和一種豬PLCs的長期培養方法。
[0008] 為了實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案：
[0009] 一種豬PLCs的體外增殖培養基，所述培養基為含10-15%FBS，55yMf3-巰基乙醇， 1%ITS，1%L-谷氨酰胺，1%核苷酸，1000IU/mL LIF，10ng/mL EGF，10ng/mL bFGF，20ng/mL PDGF-BB 和含 l%Penicilin-Stretomycin 的 DMEM 培養基。
[0010] 在其中一些實施例中，所述培養基為含15 %FBS，55μΜβ-疏基乙醇，1 % ITS，1 % L- 谷氨酰胺，1%核苷酸，l〇〇〇IU/mL LIF，10ng/mL EGF，10ng/mL bFGF，20ng/mL PDGF-BB和含 1 %卩6]1；[(3；[1;[11-31^61:01115^;[11的0]\0^[培養基。
[0011] -種豬PLCs的分化培養基，所述培養基為含10-15%FBS，55yMf3-疏基乙醇，1%L- 谷氨酰胺，500 X 膽固醇溶液，Ing/mL LH和含1 %?611；[(3；[1;[11-31^61:01115^;[11的0]\0^[培養基。
[0012] 在其中一些實施例中，所述培養基為含15%FBS，55yMf3-巰基乙醇，1%L-谷氨酰 胺，500 X 膽固醇溶液，Ing/mL LH和含1 %?611；[(3；[1;[11-31^61:01115^;[11的0]\0^[培養基。
[0013] 一種豬PLCs的長期培養方法，包括體外分離、檢測和分化方法，包括以下步驟：
[0014] (1)、利用豬PLCs的體外增殖培養基培養仔豬睪丸成纖維細胞，每天半量換液，利 用增殖培養基培養5~8天后，即可得到克隆集落;利用增殖培養基體外持續培養6個月，可 以維持體外自我更新，維持成纖維狀的未分化狀態，表達PDGFRA1和LIFR干性標記，不表達 分化標記30-HSD;
[0015] (2)、檢測步驟(1)獲得的克隆集落，證明其為豬PLCs;
[0016] (3)、利用豬PLCs的分化培養基培養間質祖細胞第3天后，豬PLCs開始向成熟睪丸 間質細胞分化;培養15天后，完全分化為成熟睪丸間質細胞。
[0017]在其中一些實施例中，步驟(1)中培養7天。
[0018] 在其中一些實施例中，步驟(3)中培養15天。
[0019] 在其中一些實施例中，步驟(2)中所述檢測包括功能蛋白檢測、膜表面蛋白分析、 和多潛能性分析(是否具有向脂肪和成骨細胞分化和堿性磷酸酶染色活性）。
[0020] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0021] 1、本發明通過大量實驗篩選，首次建立起一套成熟的豬PLCs的分離、培養、檢測和 分化的完善方法，最終確立的體外培養體系可以實現控制豬PLCs在體外維持增殖，也可以 在特定的分化系統下向成熟間質細胞、脂肪、成骨細胞分化等。豬PLCs對于可以深入研究期 生物學性質和在動物育種和人類醫學模型上應用等具有重要的前景，本發明的方法對于體 外研究PLCs生物學性質，以及藥物研發和疫苗生產等方面應用具有潛在應用價值，對于優 選種公豬的豬育種也具有潛在應用前景。
[0022] 2、本發明的方法可以直接應用于豬PLCs生物性質研究，在豬的育種研究中具有潛 在應用價值。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發明的一種豬PLCs的長期培養方法的流程圖；
[0024]圖2是本發明實施例1的體外分離豬PLCs過程的克隆集落圖和RT-PCR檢測結果;其 中A:體外高效獲得PLCs克隆集落;B: RT-PCR檢測結果；
[0025] 圖3為本發明實施例2中組織化學染色和免疫熒光檢測豬PLCs的功能蛋白的結果；
[0026] 圖4為本發明實施例3中流式分析豬PLCs的膜表面蛋白的結果；
[0027] 圖5為本發明實施例4中對豬PLCs的多潛能性分析；
[0028]圖6為本發明實施例5中豬PLCs向成熟間質細胞誘導分化的檢測結果，其中，B、C、 D、E和F:分別為誘導豬PLCs向間質分化過程中的第1、3、6、9、12和15天觀察結果;G:睪酮檢 測結果;H:RT-PCR檢測結果；I、J、K、L、M和N:分別為PDGFRAl、LIFR、CYPllAl、CYP17Al、StAR 和3i3-HSD免疫熒光染色結果。
【具體實施方式】
[0029]下面結合附圖和具體實施例來對本發明作進一步說明。
[0030] 以下實施例中，roGFRal (兔源）、3f3-HSD(兔源）、CD73(兔源）和CD44(大鼠源）單抗 購于Abea