一種提高人間充質干細胞功能的細胞處理方法
【專利說明】一種提高人間充質干細胞功能的細胞處理方法
[0001] 本發明研究得到以下課題資助：國家973計劃基礎重點研究干細胞項目 (2012CB966504);國家自然科學基金委面上項目（81170459);國家863計劃干細胞應用項 目（2011AA020118);天津市應用基礎及前沿技術研究計劃（11JCYBJC27400)。 發明領域
[0002] 本發明涉及間充質干細胞領域，尤其是間充質干細胞的趨化標記物及其功能調 To
【背景技術】
[0003] CD26
[0004] ⑶26是高度保守的II型糖蛋白，目前已在20多個物種中發現。其膜結合形式屬于 脯氨酰寡肽酶家族。相比于該家族其它成員包含一個7葉螺旋槳結構域而言，CD26具有獨 特的 8 葉螺旋獎結構域（參見 H. Hiramatsu 等，Biochemical and Biophysical Research Communications, 302 :849-854, 2003)。CD26 的編碼基因可參見 NCIB ID 1803。
[0005] CD26又名二肽基肽酶IV (Dip印tidyl p印tidase IV，DPPIV)，具有絲氨酸蛋 白酶的酶切活性，其單體所包含的766個氨基酸，可劃分為5個區域：C端催化結構域 (522-766)、半胱氨酸富含區（324-551)、高度糖基化區（29-323)、跨膜區（7-28)、胞內區 (1-6)。目前已經發現DPPIV的多種底物，比如基質細胞衍生因子-1 a (SDF-1 α )和G-CSF。
[0006] ⑶26還被稱為ADA結合蛋白，因為其能結合腺苷酸脫氨酶（ADA)，作為Τ細胞共刺 激分子發揮作用。
[0007] 間充質干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs)
[0008] 間充質干細胞因能分化成間質組織而得名，是一類具有自我更新和多向分化能力 的成體干細胞。特定條件下，間充質干細胞也可能實現跨胚層的組織分化，其多向分化能 力使得其有別于造血干細胞的單向分化。在體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、軟骨、 骨、肌肉、肌腱、神經、肝、心肌、胰島β細胞和內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍 保存后仍具有多向分化潛能。不論是自體還是同種異源的間充質干細胞，一般都不會引起 受體的免疫反應。
[0009] 間充質干細胞最早在骨髓中發現，隨后還發現具有相同功能特征的間充質干細胞 廣泛存在于人體發生、發育過程的許多種組織中。2006年國際細胞治療協會（ISCT，the International Society for Cellular Therapy)確定的間充質干細胞鑒定標準是：
[0010] -在塑料培養皿內貼壁生長，在血清培養基中高度增殖；
[0011] -表達間充質相關抗原⑶105,⑶73和⑶90 ;
[0012] -不表達造血細胞和內皮細胞相關抗原⑶45、⑶34、⑶14、⑶11b、⑶79a和⑶19b ;
[0013] -體外分化成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞。
[0014] 目前已能從骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺以及羊水、臍帶血、胎盤等多 種組織中分離和制得間充質干細胞。
[0015] 間充質干細胞能定向迀移到腫瘤細胞、損傷組織和細胞，因此，一直是腫瘤治療、 以及骨組織、心肌、腦組織的損傷修復等領域的熱點。間充質干細胞也是造血微環境的原始 細胞，在移植造血領域具有很好的應用前景。
[0016] 在間充質干細胞趨化其它細胞的迀移方面，霍思維等人（人胎盤間充質干細胞對 臍血CD34 +細胞迀移能力的影響，中國科學：牛命科學，2010, 40 (5) :399-407)發現，胎盤間 充質干細胞能分泌多種造血因子和黏附因子，他們由此懷疑并隨后證實了其對臍血⑶34+ 細胞具有迀移作用，而且還證實，胎盤間充質干細胞比SDF-1對⑶34+細胞有更強的趨化迀 移作用，這是與胎盤間充質干細胞表達多種細胞因子密不可分的。計流等（間充質干細胞 通過旁分泌效應激活心臟干細胞i千移，湖北醫學院學報，2012,第4期）報道了間充質干細 胞對心臟干細胞具有趨化迀移作用。
[0017] 但迄今為止，未發現關于間充質干細胞趨化其它細胞的能力如何調節的報道。
[0018] 發明概述
[0019] 本發明人是首次發現，表達在間充質干細胞表面的CD26分子可以作為間充質干 細胞趨化能力的標志物，通過調節間充質干細胞表面的CD26分子的水平或其酶活性，可以 改變間充質干細胞的趨化能力，從而為進一步的應用提供益處。
[0020] 具體地，在本發明的一個方面，涉及體外處理間充質干細胞的方法，其通過抑制間 充質干細胞表面的CD26分子來增強所述干細胞的趨化能力。在一個實施方案中，所述抑制 是用CD26抑制劑來實現。本領域已知的CD26抑制劑包括核酸水平的抑制劑、蛋白水平的 抑制劑、以及生物活性水平的抑制劑，核酸抑制劑例如CD26-shRNA、CD26-siRNA等，本領域 技術人員可以基于CD26的序列信息設計出相應的抑制劑序列；核酸抑制也可采用基因敲 除實現，如TALEN、CRISPR/cas9等基因敲除技術；蛋白抑制劑例如特異性抗體；生物活性抑 制劑例如酶抑制劑，諸如DiprotinA、DiprotinB、西格列汀、沙格列汀、維格列汀、利格列汀、 阿格列汀等，優選DiprotinA。
[0021] 相應地，本發明另一方面涉及上述CD26抑制劑在增強間充質干細胞的趨化能力 方面的用途。為此，可以將上述的CD26抑制劑直接用作間充質干細胞趨化增強劑或者用于 制備間充質干細胞趨化增強劑。
[0022] 本發明又一方面涉及篩選或分選間充質干細胞的方法，通過以⑶26作為標志物 來篩選或分選趨化能力強的間充質干細胞。可以通過流式細胞術或磁珠來進行所述的篩選 或分選。在篩選或分選過程中，可以采用CD26檢測劑，如抗CD26抗體。所述的CD26檢測 劑如抗CD26抗體還可以用于檢測間充質干細胞的趨化能力。一或多種CD26檢測劑可以以 試劑盒的形式出現，用于篩選或分選間充質干細胞。
[0023] 本發明又一方面涉及促進造血干細胞移植的方法，是選用⑶26?司充質干細胞或 經⑶26抑制劑處理的未經分選的間充質干細胞、或經⑶26抑制劑處理的⑶26+間充質干 細胞，與造血干組細胞聯合移植。為此，將用到間充質干細胞（優選CD261司充質干細胞）， 尤其是聯合用到CD26抑制劑和間充質干細胞兩者。相應地，本發明涉及間充質干細胞（優 選CD261司充質干細胞）、或者CD26抑制劑與間充質干細胞的組合在制備造血干細胞移植 促進劑方面的用途。
[0024] 本發明所述的間充質干細胞優選是人的間充質干細胞。
【附圖說明】
[0025] 圖1顯示FL-MSCs，FBM-MSCs和PL-MSCs趨化臍帶血來源CD34+造血干祖細胞的 能力。
[0026] 圖2顯示流式細胞術檢測不同造血組織來源的間充質干細胞⑶26的表達。A : FL-MSCs B:FBM-MSCs C:PL-MSCs。縱軸：細胞計數。
[0027] 圖 3 顯示 Diprotin A 抑制 CD26 能增強 FL-MSCs、FBM-MSCs 和 PL-MSCs 趨化臍帶 血來源⑶34+造血干祖細胞的能力。
[0028] 圖4顯示流式細胞儀分選⑶26_和⑶26+兩群細胞的結果。
[0029] 圖5顯示shRNA使得MSCs的CD26表達水平降低。
[0030] 發明詳述
[0031] 本文中，⑶26、DPPIV、ADA結合蛋白是可互換的術語，它們表示相同的含義。相應 地，"⑶26抑制劑"可替換為"DPPIV抑制劑"、或"ADA結合蛋白抑制劑"。同樣地，"⑶26檢 測劑"可替換為"DPPIV檢測劑"、或"ADA結合蛋白檢測劑"。
[0032] 本文中，"⑶26抑制劑"是指抑制⑶26分子的表達或活性、或者破壞或封閉⑶26 分子本身的物質，例如小分子、核酸、核酸類似物、蛋白、抗體、肽、適配體或其變體或片段。 具體地，抑制CD26分子的表達可以通過多種核酸試劑來進行，例如RNAi試劑，諸如siRNA、 shRNA、miRNA、dsRNA或核酶或其變體等等，又例如基因敲除劑或基因敲低劑，如TALEN( "轉 錄激活物樣效應物與核酸酶的融合提"，其通過在細胞DNA中產生靶向性雙鏈斷裂而產生特 定的遺傳修飾）、CRISPR/cas9等。抑制CD26分子的活性，例如酶活性，可以用到酶抑制劑， 例如 DiprotinA(Ile-Pr〇-Ile, Sigma Cat. 19759)、DiprotinB(Val-Pr〇-Leu，ApexBio Cat. C43631)、西格列汀（Januvia，MK-〇431，Merck&Co，La Jolla，CA)、沙格列汀（Onglyza，BSM_ 477118，131^81:〇1-]\15^『8 3911；[1313，如￥￥0『1<:，附）、維格列汀（2011161818，1^^237，1^0￥&1:18，13已8 el, Switzerland)、利格列汀（Linagliptin, BI-1356, Boehringerlngelheim, Ingelheim, Ge rmany)、阿格列汀（Alogliptin, SYR-322, Takeda Pharmaceutical Company, Osaka, Japan) 等等。破壞或者封閉CD26分子本身，例如細胞表面表達的CD26分子，可以用到小分子化合 物，或者特異性抗CD26的抗體，如單克隆抗體，或其各種活性片段。
[0033] 本文中，"⑶26檢測劑"是指檢測⑶26的表達水平或⑶26的酶活性的試劑。例如， 抗CD26抗體（尤其是單克隆抗體），CD26的酶活性底物，等等。所述抗體例如是單克隆抗 體。優選地，所述抗體帶有標記，如熒光標記、化學發光標記、放射性核素標記等等。
[0034] 本文中，"間充質干細胞的趨化能力"是指間充質干細胞趨化其它細胞、使其它細 胞迀移的能力，"間充質干細胞趨化增強劑"是指使間充質干細胞的上述趨化能力增強的物 質。已知的能被間充質干細胞趨化的細胞例如有，臍血CD34 +細胞（霍思維等，同上）、心臟 干細胞（計流等，同上）。
[0035] 本發明人以臍血CD34+細胞為例，首次研究了間充質干細胞趨化其它細胞的能力 的調節機制。已知在造血細胞中CD34分子選擇性地表達于人類及其他哺乳動物的造血干 /祖細胞（hematopietic stem/progenitor cell，HSC/HPC)表面，并隨細胞的成熟逐漸減 弱至消失。
[0036] 本發明人首先檢測了不同胎兒組織來源的間充質干細胞對臍帶血CD34+細胞的 趨化能力。結果發現，胎兒肝臟來源的間充質干細胞（FL-MSCs)、胎兒骨髓來源的間充質干 細胞（FBM-MSCs)、以及胎盤來源的間充質干細胞（PL-MSCs)，與單純的SDF-1試劑相比，分 別具有其60%，70%和51 %的趨化能力。然后，本發明人檢測了這些間充質干細胞上⑶26 分子的表達，發現趨化能力最強的FBM-MSCs具有相對最少的C