表達單鏈抗體scFV或多肽適配體的功能化細菌磁顆粒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及納米磁珠應用和醫學檢測領域，具體是涉及表達單鏈抗體scFV或多肽 適配體的功能化細菌磁顆粒及其應用。
【背景技術】
[0002] 細菌磁顆粒是趨磁細菌生產的一種磁性納米顆粒，內核是Fe304晶體，外面有一層 磷脂生物膜包被，粒徑在30-120nm之間。同一種趨磁細菌生產的細菌磁顆粒粒徑大小和晶 體晶型基本一致，磁學性質均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性質和膠體性質。此 外，因為細菌磁顆粒是生物來源，因此具有較好的生物相容性。細菌磁顆粒膜上帶有大量的 氨基基團，可通過化學修飾和雙功能偶聯劑連接不同的功能大分子，如抗體，從而具有不同 的特殊功能。細菌磁顆粒最獨特的地方在于它可以通過基因工程的方法在細菌磁顆粒膜上 表達特殊的蛋白質，功能性的靶蛋白可以在細菌磁顆粒上展示出來。
[0003] 細菌磁顆粒修飾抗體一直是其功能化應用的重要方面，最常見的是通過雙功能偶 聯試劑進行化學修飾，此外還有通過表達親和蛋白特異性結合抗體的生物修飾。基因工程 抗體又稱重組抗體，是通過重組DNA及蛋白質工程技術改良抗體性能，主要是對編碼抗體的 基因按不同需要進行加工改造和重新裝配。其中的單鏈抗體scFV由抗體重鏈可變區（V H)和 輕鏈可變區（Vl)通過20個左右的氨基酸短肽（linker)連接而成。單鏈抗體scFV可以認為是 完整抗體的部分片段，比完整抗體要小，可以在原核表達系統中表達。其優點是非特異性結 合少，在基因工程上最容易做成抗體融合蛋白，其缺點是缺少Fc結構域片段的保護，在體內 容易降解。多肽適配體源于噬菌體展示技術，一般是一段10-20個殘基的多肽，其作為適配 體能與相應的配體進行高親和力和強特異性的結合，具有抗體性質。多肽適配體的篩選是 化學生物學和生物醫學的交叉，提供了一種對靶標配體(可以是抗原、大分子藥物、毒素、天 然產物等大分子物質)高效快速識別的研究平臺，在診斷、化學分析等許多方面顯示了良好 的應用前景。但是多肽適配體與其靶標配體結合后的分離過程比較復雜，因此嚴重限制了 多肽適配體的應用。現有技術公開了利用偶聯劑或交聯劑分別將酶、抗體連接在細菌磁顆 粒上，構建磁性復合物，用于固定化酶或檢測病原菌等有害物質;這些方法的構建都是直接 將細菌磁顆粒與上述物質偶聯，而CN104278048公開了 一種重組質粒，該質粒通過磁螺旋菌 野生型菌株MSR-1的基因組DNA為模板，通過帶有(GLy4S er)3Linker的引物擴增得到生物素 羧基載體蛋白基因。現有技術公開的linker的氨基酸序列短，細菌磁顆粒膜蛋白與不同的 抗體或蛋白結合后，會產生兩者的空間結構相互影響的技術問題。
【發明內容】
[0004] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種表達單鏈抗體scFV或多肽適配體的功能 化細菌磁顆粒及其應用。本發明利用細菌磁顆粒膜上可以融合表達單鏈抗體scFV或多肽適 配體的特性，通過基因工程的方法在細菌磁顆粒膜上展示具有單鏈scFV抗體和具有抗體性 質的多肽適配體。
[0005] 本發明具體技術方案如下：
[0006] 本發明提供一種表達單鏈抗體scFV或多肽適配體的功能化細菌磁顆粒，該功能化 細菌磁顆粒的結構物質由單鏈抗體scFV或多肽適配體通過多肽鏈與細菌磁顆粒膜蛋白融 合表達而成。
[0007] 進一步的改進，該多肽鏈的氨基酸殘基為饑（41&26175打) 3(41&61735打41&^ (GlySerAla2)a]，Q = l-3，a = l-4，b = 4_7〇
[0008] 本發明通過提供的多肽鏈是一般柔性linker多肽長度的3倍;并且其兩端和中間 增加了剛性的Ala殘基，以此用于穩定兩個不同蛋白的空間結構，并且克服了兩個蛋白之間 存在著相互影響的技術問題。
[0009] 進一步的改進，所述功能化細菌磁顆粒的結構物質由單鏈抗體scFV通過多肽鏈與 細菌磁顆粒膜蛋白融合表達而成；所述多肽鏈的氨基酸殘基為（Ala2GlySer)3 (AlaGly 3SerAla)5(GlySerAla2)3,多肽鏈的序列為 5-
[0010]
<如 SEQ:IDN〇、l 所示）。
[0011] 進一步的改進，所述功能化細菌磁顆粒的結構物質由多肽適配體通過多肽鏈與細 菌磁顆粒膜蛋白融合表達而成；所述多肽鏈的氨基酸殘基為2[(Ala2GlySer)2 (AlaGly 3SerAla)6(GlySerAla2)2]，多肽鏈的序列為5-
[0012]
所示）。
[0013] 以上限定的多肽鏈序列可以有效地轉錄。
[0014] 進一步的改進，所述單鏈抗體scFV為anti-⑶19單鏈抗體，所述多肽適配體為MUC1 適配體或CTLA4適配體。
[0015] 本發明另一方面提供了表達單鏈抗體scFV或多肽適配體的功能化細菌磁顆粒在 用于抗原的磁分選，用于蛋白質、藥物分子或天然產物的富集純化及分離提取，或用于制備 清除腫瘤細胞或組織的復合物中的應用。
[0016] 本發明另一方面提供一種表達單鏈抗體scFV或多肽適配體的功能化細菌磁顆粒 的制備方法，該方法包括如下步驟：
[0017] a.構建細菌磁顆粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趨磁細菌MSR-1突變株；
[0018] b.構建功能化細菌磁顆粒膜蛋白融合表達質粒；
[0019] c.將功能化細菌磁顆粒融合表達質粒通過接合轉入到步驟&制得的趨磁細菌MSR-1突變株，構建趨磁細菌MSR-1重組株；
[0020] d.對趨磁細菌MSR-1重組株進行培養；
[0021 ] e.分離純化，制得功能化細菌磁顆粒。
[0022]進一步的改進，步驟a所述構建細菌磁顆粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趨磁細菌 MSR-1突變株的具體方法為：
[0023] (a)擴增細菌磁顆粒膜蛋白mamC/mamF基因左右兩側共兩個長均為700-1000bp的 同源片段;左右兩同源片段均帶有兩個酶切位點；
[0024] (b)左右同源片段分別用相應的限制性內切酶進行雙酶切；同時對自殺質粒 pKmobsacB進行雙酶切；
[0025] (c)將經過雙酶切后的左右同源片段和經過雙酶切后的自殺質粒pKmobsacB進行 連接，連接產物轉到E.coli感受態細胞中，挑選連接正確的陽性克隆菌；
[0026] (d)將陽性克隆菌作為供體與趨磁細菌MSR-1受體菌進行親本接合，并導入 pKmobsacB重組質粒，通過卡那抗性篩選趨磁細菌MSR-1同源整合突變株，突變株再通過蔗 糖梯度篩選趨磁細菌MSR-1雙交換突變株，最后選擇卡那抗性敏感的雙交換菌株進行驗證， 構建成細菌磁顆粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趨磁細菌MSR-1突變株；
[0027] 步驟b所述功能化細菌磁顆粒膜蛋白融合表達質粒的構建方法如下：
[0028] (1)擴增細菌磁顆粒膜蛋白mamC/mamF基因跨膜結構域的DNA片段，所述DNA片段兩 端分別帶有雙酶切位點；對擴增產物DNA片段及pBBR質粒進行雙酶切，回收雙酶切的DNA片 段及雙酶切的PBBR質粒;將雙酶切的DNA片段與雙酶切的pBBR質粒進行連接，連接產物轉化 大腸桿菌感受態細胞中，篩選連接正確的陽性克隆，得到重組質粒PBBR-細菌磁顆粒膜蛋白 mamC/mamF基因；
[0029] (2)單鏈抗體scFV或多肽適配體的編碼序列克隆在pUC57載體上，并分別在其5'端 合成編碼表達多肽鏈Q[ (Ala2GlySer)a(Ala Gly3SerAla)b(GlySerAla2)a]，Q= l_3，a= 1-4， b = 4-7的基因序列，在合成基因序列兩端分別加上雙酶切位點，制得多肽鏈-單鏈抗體scFV 或多肽適配體質粒；
[0030] (3)對步驟(2)基因合成得到的多肽鏈-單鏈抗體scFV或多肽適配體質粒進行擴增 和雙酶切；
[0031 ] (4)對步驟（1)得到的重組質粒pBBR-細菌磁顆粒膜蛋白mamC/mamF基因進行雙酶 切并純化，和步驟(3)得到的經過雙酶切的多肽鏈-單鏈抗體scFV或多肽適配體質粒的基因 片段進行連接，連接產物轉化大腸感覺感受態細胞中，篩選并驗證連接正確的陽性克隆，最 終得到功能化細菌磁顆粒膜蛋白融合表達質粒pBBR-細菌磁顆粒膜蛋白mamC/mamF基因-多肽鏈-單鏈抗體scFV或多肽適配體；
[0032]步驟c的具體制備方法為：
[0033] I以功能化細菌磁顆粒膜蛋白融合表達質粒pBBR-細菌磁顆粒膜蛋白mamC/mamF 基因-多肽鏈-單鏈抗體scFV或多肽適配體作為供體，通過親本接合實驗將其導入到細菌磁 顆粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趨磁細菌MSR-1突變株，構建生產功能化細菌磁顆粒的趨 磁細菌MSR-1重組株。
[0034]進一步的改進，步驟d中對趨磁細菌MSR-1重組株進行培養包括如下步驟：
[0035] d-a.向培養罐中加入第一培養基，紫外線滅菌5-7min，靜置lh后，將趨磁細菌MSR-1重組株接種到培養罐中，進行第一次培養，獲得第一培養液;第一次培養的條件為:起始pH 值為4.5-5.1，培養溫度為20-25 °C，培養時間為5-7天，搖床轉速為120-150轉/分鐘，培養過 程中通入氧氣，通入氧氣的方式為：間隔5min，通入20min氧氣；
[0036] d-b.將第一培養液加入含有第二培養基的培養罐中，無氧狀態進行第二次培養； 第二次培養的條件為:起始pH值為5.7-5.9，培養溫度為30-32°C，培養時間為2-3天，搖床轉 速為200-250轉/分鐘。
[0037] 進一步的改進，所述第一培養基由重量份數為10-12份生物素、0.8-1.2份多聚谷 氨酸、1-2份殼聚糖、1-3份磷酸二氫鈉、0.5-1份脂肪酸乳酰酯、0.1-0.3份抗壞血酸鈉、0.5-1份海藻酸銨和1-2份硝酸鉀組成；
[0038]所述第二培養基由重量份數為1-1.5份瓊脂、0.2-0.5份普魯蘭、1-2份6-芐基氨基 嘌呤、0.5-1份異丙醇胺、1-2份硝酸銨、0.5-1份聚乙二醇4000、0.5-0.7份氯化鈣、0.2-0.5 份維生素 E和0.2-0.5份木糖醇酐單油酸酯組成。
[0039]本發明所提供的培養步驟不但能夠提高對趨磁細菌MSR-1重組株的擴增能力，同 時能夠增強細菌磁顆粒對單鏈抗體scFV或多肽適配體的負載能力。進一步的改進，步驟e所 述的分離純化具體步驟如下：
[0040] 1)離心并收集培養后的趨磁細菌MSR-1重組株，用磷酸鹽緩沖液懸浮，得懸浮液；
[0041] 2)超聲波破碎懸浮液中的細胞；
[0042] 3)磁力裝置吸附破碎后的細胞，靜置過夜，棄去上清，用磷酸鹽緩沖液重新懸浮吸 附到的沉淀，超聲波清洗，磁力裝置再次吸附，棄上清，將吸附到的沉淀用磷酸鹽緩沖液懸 浮，洗滌3次，即得功能化細菌磁顆粒