一株減毒豬霍亂沙門氏菌及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一株減毒豬霍亂沙門氏菌及其制備方法和應 用。
【背景技術】
[0002] 隨著新老傳染病的不斷流行，研究和開發有效防治傳染病的方法顯得極為迫切。 在過去兩百多年中，疫苗在防止細菌或病毒性傳染病中發揮了巨大的作用。由于疫苗相對 于大多數藥物而言，具有使用成本低的優勢，因此，不斷的研究和開發疫苗是十分必要的。
[0003] 在疫苗研究領域中，利用沙門氏菌作為載體已經得到了廣泛的研究。然而，目前對 沙門氏菌，特別是某種沙門氏菌(如豬霍亂沙門氏菌）的毒力基因，尚未完全研究清楚。在過 去二十多年中，得到廣泛認同的減毒沙門氏菌疫苗候選株為數不多，如營養缺陷型突變株 (aroA、aroCD、purA)、壓力反應缺陷株(htrA)、腺苷酸環化酶缺陷株(cya、crp)等。
[0004]造成有效的減毒菌株開發數量少并困擾研究人員的主要問題之一是:在眾多已發 現或可能的毒力基因中，并未得到哪些毒力基因一定適用于某類或某種減毒菌株的構建的 確切認識。因而，對于具體某種細菌的減毒構建而言，需要進行大量實驗確定相關的毒力因 子，并尋求適用于該菌株的減毒構建方案。對于研究較少的細菌而言(如豬霍亂沙門氏菌）， 減毒菌株的研究工作更顯得十分困難。
[0005] 在減毒豬霍亂沙門氏菌載體構建的研究領域中，有效的菌株主要為galE突變株、 aroA突變株、cya/crp突變株、以及其它基于slyA、hilA等基因而構建的突變株。目前而言， 對于是否還可以采取其它方法對豬霍亂沙門氏菌進行減毒構建，尚未十分清楚。因此亟待 開發其它對豬霍亂沙門氏菌有效的減毒構建方法，以深化對減毒菌株構建乃至相關疫苗研 究的認識。
【發明內容】
[0006] 針對現有技術的缺點，本發明的目的之一在于提供一株減毒豬霍亂沙門氏菌 S.Cholerasuis S1209,其特征在于，所述減毒豬霍亂沙門氏菌S.Cholerasuis S1209缺失 wzx基因，分類命名為Salmonella choleraesuis S1209,保藏于武漢市武昌珞珈山的中國 典型培養物保藏中心(武漢大學）中國典型培養物保藏中心，保藏號為:CCTCC Μ 2015631， 保藏時間為:2015年10月22日。
[0007] 本發明的發明人經過大量的實驗發現wzx基因與豬霍亂沙門氏菌的毒力具有較強 關系，通過敲除其wzx基因可以獲得減毒效果好的減毒菌株。原因可能在于wxz基因構成沙 門氏菌〇抗原LPS結構的翻轉酶，而LPS結構對于沙門菌的毒力具有重要作用。
[0008] 需要指出的是，目前對于哪些是豬霍亂沙門氏菌的主要毒力基因尚未建立確切的 理論指導，在其它沙門氏菌或者其它需要進行減毒設計的菌種中行之有效的減毒方案，對 于豬霍亂沙門氏菌而言并不奏效或效果較差。如本發明的一個實施例所示，當進行wzy基 因、wbaB基因、wbaC基因、manB基因、manC基因缺失處理時，所得處理后的豬霍亂沙門氏菌菌 株要么不具備減毒效果、要么減毒效果不理想。
[0009] 如本發明的實驗例所示，本發明所得菌株具有非常良好的減毒效果。
[0010] 本發明對本領域的貢獻之一在于，發現了 WZX基因與豬霍亂沙門氏菌毒力的關系， 并構建了一株減毒效果優秀的豬霍亂沙門氏菌。
[0011] 本發明的第二個目的在于提供制備上述減毒豬霍亂沙門氏菌S.Cholerasuis S1209的方法，該方法包括如下步驟：
[0012] 1)對wzx基因的上同源臂和下同源臂進行擴增；
[0013] 2)用豬霍亂沙門菌C3545基因組為模板，擴增wzx的下同源臂和下同源臂；
[0014] 3)融合片段構建：以wzx基因片段的上同源臂和下同源臂為模板，擴增同源臂融合 片段；
[0015] 4)用Ahdl酶切質粒PRE112,回收純化酶切產物，用連接試劑盒連接PRE112大片段 與同源臂融合片段，連接產物經轉化和質粒抽提后，得到質粒pRE112-A WZX;
[0016] 5)將質粒PRE112- Δ wzx轉入C7232菌株感受態細胞，以含有質粒PRE112- Δ wzx的 c7213菌株為供體菌，以C3545菌株作為受體菌，進行結合轉移，經PCR鑒定后，得到減毒豬霍 亂沙門氏菌3.〇1〇16瓜81118 31209;
[0017] 所述wzx基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0018]所述wzx基因片段的上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0019] 所述wzx基因片段的下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0020] 用于擴增wzx基因的上同源臂的引物為：
[0021] Dwzx-1F：CCGCTGATGGAAGTGCGAACG
[0022] Dwzx-1R：ggttaacttattttactttccggatgtaaac
[0023] 用于擴增wzx基因的下同源臂的引物為：
[0024] Dwzx~2F：gtaaaataagttaaccaagcgggaaaatatc
[0025] Dwz x-2R:GATTCAACAAACTCTTTCACCG。
[0026] 步驟1)中，對wzx基因的上同源臂進行擴增時，擴增片段大小為346bp;對wzx基因 的下同源臂進行擴增時，擴增片段大小為333bp。
[0027] 在步驟2)中進行擴增時，PCR反應體系為：于50yL反應體系中進行，具體反應體系 為模板DNA lyL，Takara高保真酶25yL，上、下游引物各lyL，ddH20 22yL;具體條件為：98°C 變性2min后進入循環，循環參數為98°(：108,55°(：158,721€30 8，共循環30次;循環后72°(：延 伸lOmin。
[0028] 在步驟3)中進行融合片段構建時，PCR反應體系為：于50yL反應體系中：上下游同 源臂DNA各lyL，Takara高保真酶25yL，ΙΟμπιο 1/L上、下游引物各lyL，ddH20 22yL;具體條件 為:98°C變性5min后進入循環，循環參數為98 °C 10s，55°C 15s，72°C 30s，共循環30次;循環后 72°C 延伸 10min。
[0029] 步驟5)所述結合轉移步驟為：用含DAP的液體LB培養基培養供體菌，用LB培養基培 養受體菌，至OD600為0.6左右，取供體菌500ul，受體菌300ul于含氯霉素抗性(25yg/mL)平板 一側混勻，平板斜放，正放培養24h，挑取菌苔，劃線，37°C靜止培養，直至得到單菌落，得到 的單菌落進行蔗糖負篩。所述蔗糖負篩的步驟為:挑取單菌落加入無 NaCl的LB液體培養基， 于37°C，70rpm下，搖菌2h，取100ul菌液10倍倍比稀釋1000倍后，再取100ul菌液涂含10%蔗 糖的LB平板。
[0030] 步驟5)所述PCR鑒定，步驟為：
[0031]對長出單菌落的蔗糖平板，選擇一個區域進行挑菌，每個菌落同時分別劃線于Cm 板LB板，挑菌時沾到即可不要挑到菌落下方菌；
[0032]鑒定并存菌，在于挑取10~20個Cm不生長，LB生長的菌落，得到的陽性菌落再次劃 線LB板后，PCR鑒定，仍為陽性者，為缺失株構建成功；
[0033] PCR反應體系：up水4.4ul、模板DNA 0.2ul、上同源臂上游引物0.2ul、下同源臂下 游引物〇.2ul、Pfu PCR Master(KP201)5ul;PCR反應條件：94°C預變性5min、94°C變性30s、 55°C退火30s、72°C延伸lmin、72°C延伸lOmin、變性至延伸步驟重復30個循環。
[0034]本發明的另一個目的在于提供上述減毒豬霍亂沙門氏菌S.Cholerasuis S1209在 疫苗上的應用。
[0035]本發明的有益效果：
[0036] 本發明發現了 wzx基因與豬霍亂沙門氏菌毒力之間的關系，所得菌株減毒效果好， 可用于疫苗的制備。
【附圖說明】
[0037] 圖1為對本發明菌株進行銀染的結果圖；其中第1泳道為野生菌，第3泳道為本發明 所得菌株。
【具體實施方式】
[0038] 下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用 于對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練 人員根據上述
【發明內容】
所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。 [0039] 實施例1
[0040] 1、引物設計(用于突變株的構建與鑒定）
[0041] 參考豬霍亂沙門菌SC-67全基因組序列，設計2對引物分別用于缺失wzx基因 (Dwzx-lF/Dwzx-lR，Dwzx-2F/Dwzx_2R)。從豬霍亂沙門菌C3545中分別擴增wzx基因的上下 游片段:up-wzx(上同源臂)和down-wzx(下同源臂），擴增片段大小分別為346bp和333bp。
[0042] Dwzx-1F：CCGCTGATGGAAGTGCGAACG
[0043] Dwzx-1R：ggttaacttattttactttccggatgtaaac
[0044] Dwzx~2F：gtaaaataagttaaccaagcgggaaaatatc
[0045] Dwzx-2R：GATTCAACAAACTCTTTCACCG
[0046] 2、豬霍亂沙門菌C3545wzx突變株的構建
[0047] 用已提取的豬霍亂沙門菌C3545基因組為模板，分別用引物Dwzx-IF/Dwzx-IR， Dwzx_2F/Dwzx_2R擴增wzx基因的上下游同源臂。
[0048] PCR反應體系為：50yL反應體系中進行，具體反應體系為模板DNA lyL，25mmol/L MgCl2 0.5yL，buffer 10yL，10ymol/L上、下游引物各lyL，2mmol/L dNTPs lyL，DNA polymerase 0.75yL，ddH2〇 34.75yL。具體條件為：98°C變性5min后進入循環，循環參數為 94°C30s，55°C30s，72°Clmin，共循環30次。循環后72°C延伸lOmin。擴增的產物經1%的瓊脂 糖凝膠電泳分析后，由DNA純化回收試劑盒純化PCR產物。
[0049] 3、重組自殺質粒的構建
[0050] 融合片段的構建：以純化的wzX