耐酸反硝化的枯草芽孢桿菌及復合微生物菌劑和制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一種耐酸反硝化的枯草芽孢桿菌及復合微生物菌劑。
【背景技術】
[0002] 近20年在北方地區溫室大棚蔬菜得到迅猛的發展，但是在生產過程中多數菜農忽 視了溫室大棚內土壤的管理。在追求溫室大棚蔬菜優質、高產、高效的目標下，努力提高復 種指數，盲目增加施肥數量和次數。例如在山東壽光蔬菜溫室大棚在栽培過程中生鮮畜禽 糞便施用量一般在90-150m 3/hm2，最高超過200m 3/hm2;化肥投入量一般在7500kg/hm2左右， 遠遠超出蔬菜的吸收量。大量的含氮化肥和有機肥料分解產物在好氧條件下經硝化作用轉 化為硝態氮積累在土壤中，導致大棚土壤中硝態氮含量急劇上升。同時由于溫室大棚中缺 少雨淋，表層積鹽不能淋洗到土壤深層，加上溫室大棚中溫度高，土壤中的鹽分隨著水的蒸 騰作用向土壤的表層聚集。在溫室栽培條件下，土壤鹽漬化的主要特點之一是硝酸鹽積累。 研究表明溫室表層土壤中的硝酸根約占陰離子總量的67-76%，最高達到0.66g/kg 硝酸根離子的大量積累不僅造成溫室大棚土壤的鹽漬化，而且NO廠強酸性陰離子在全 鹽含量中所占比例大幅上升導致溫室大棚的土壤pH值下降。隨著溫室大棚種植年限的增 加，土壤的pH也不斷降低。北方一些蔬菜大棚土壤pH值由原來的7-8降低到4-5,導致大棚土 壤的理化性質和生物活性惡化，病蟲害嚴重發生，蔬菜品質和產量顯著下降。
[0003] 目前針對我國設施栽培大棚土壤鹽漬化和酸化的情況，采取了一些治理措施，如 灌水洗鹽，土壤改良劑法等方法。雖然這些方法有不少優點，但也存在很大的不足:灌水洗 鹽會把硝態氮淋洗到地下，污染地下水;土壤改良劑法成本比較高，且多利用化工原料或工 業廢棄物作為原料，也產生了土壤復酸化、重金屬污染等問題。
[0004] 對現有技術的檢索發現申請號為201510471378.4的中國發明專利申請公開了"一 種能改良酸化土壤的肥料添加劑"。其主要成分主要包括：蒙脫石粉、泥炭土、淤泥、落葉碎 末、石榴皮、雙氰胺、硫脲、活性炭、果渣、貝殼粉、硅鈣粉、木質素、EM菌劑、枯草芽孢桿菌菌 劑、復配除臭劑。可將甘蔗種植地土壤PH由4.6提高到5.7。但其使用的EM菌、枯草芽孢桿菌 并未經過針對大棚酸性土壤特別篩選，其對土壤中硝酸鹽氮的反硝化或分解效果不明。該 發明改善土壤pH的有效成分主要是蒙脫石粉這一天然礦物，通過水解產生的氫氧根離子中 和土壤中的酸根離子。隨著氫氧根離子的消耗，其改善土壤pH的效果并不持久。而且現有技 術不適合用于設施大棚土壤的改良，在于蒙脫石粉水解產生的Al、Mg陽離子又會加重土壤 的積鹽的程度。
[0005] 申請號為201310512371.3的中國發明專利申請公開了一種"硝酸鹽同化細菌及其 在修復設施次生鹽漬化土壤中的應用"。通過硝酸鹽同化細菌巨大芽孢桿菌NCT-2以土壤中 硝態氮作為氮源，并將其同化為其它形態的無機氮或細胞組分，從而實現對硝態氮的降解 轉化、降低土壤中硝態氮含量并對土壤進行修復。NCT-2要針對輕度鹽漬化土壤，其在 100mg/kg 土壤中硝態氮轉化率可達98.4%，但在200mg/kg 土壤中硝態氮轉化率僅為45.5%。
[0006] 現有技術提供的反硝化枯草芽孢桿菌制劑主要針對水體的硝酸鹽除氮，水體一般 接近中性或微堿環境。例如CN02147874.0公開了一株好氧反硝化枯草芽孢桿菌制劑的制備 方法。其對蝦塘水體中的亞硝酸鹽進行反硝化去除，該枯草芽孢桿菌菌株的培養及應用pH 為7.0-9.0之間。又如0呢01510405040.9公開了一種好氧反硝化枯草芽孢桿菌制劑的制備 方法用于去除蝦塘水體中亞硝酸鹽。其菌株的培養和應用pH為7.0-8.0。我們知道強酸會造 成堿性蛋白質的功能團被中和并被降解，使蛋白質變性。因此沒有針對低pH條件進行優化 篩選的菌株，在低pH環境中活性會明顯降低甚至死亡。這些好氧反硝化枯草芽孢桿菌菌株 并不能適應北方溫室大棚土壤的低pH環境(pH低至4.0)。經試驗對比，市售用于水體的反硝 化枯草芽孢桿菌制備的復合微生物菌劑在溫室大棚土壤中的反硝化氮去除率只有53%，遠 低于本發明提供的復合微生物菌劑硝酸鹽氮去除率98%。
【發明內容】
[0007] 本發明針對北方溫室大棚硝酸鹽積累產生的高酸度和鹽漬化環境，通過紫外誘變 選育的耐酸反硝化的枯草芽孢桿菌具有高效去除北方溫室大棚土壤中的硝酸根的能力。
[0008] 為實現上述目的，本發明公開了一種耐酸反硝化的枯草芽孢桿菌，所述菌株生物 學分類命名為枯草芽孢桿菌，拉丁文名稱為Bacillus subtilis，鑒定參椐編號KD203-3,所 述菌株已于2015年11月6日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址 為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為 CGMCC No.11624。
[0009] 保藏編號為CGMCC No. 11624的耐酸反硝化的枯草芽孢桿菌通過下述步驟從土壤 中篩選、誘變選育而得： 1.反硝化出發菌株的分離純化 通過系列稀釋平板法以PH4.0的牛肉膏蛋白胨硝酸鹽固體培養基從臨淄10年棚齡的酸 化和鹽漬化土壤中挑選單菌落。用PH4.0的硝酸鹽葡萄糖反硝化液體培養基培養單菌落，分 別使用格里斯(Griess)試劑和二苯胺試劑檢測硝酸鹽葡萄糖培養基中硝態氮還原情況，在 反硝化能力強的菌株培養液中再檢測硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的濃度，最終篩選出耐酸反硝 化能力強的野生型出發菌株KD203。
[00? 0]所述的牛肉膏蛋白胨硝酸鹽培養基為:5g牛肉浸膏、10g蛋白胨、5g氯化鈉、lg硝酸 鉀、20g瓊脂，1000mL蒸餾水。
[0011]所述的硝酸鹽葡萄糖反硝化培養基為：5g葡萄糖、2g硝酸鉀、lgKH2P〇4、lgK2HP〇4、 0 · 20gMgS〇4.7H20、1 OOOrnL 蒸餾水。
[0012] 2.野生型出發菌株的誘變篩選 將野生型出發菌株KD203接種到pH4.0的牛肉膏蛋白胨硝酸鹽液體培養基，30 °C條件 下，轉速120rpm，培養24h，獲得菌濃度在101()個/ml以上的菌液。取菌液50ml，離心，收集菌 體。在菌體中加入無菌水制備等體積菌懸液，分裝成5個平皿，用紫外線照射各皿。紫外燈功 率20w，平皿離紫外燈距離20cm，照射時間為60s。將處理液稀釋至每毫升含10 2-104個菌數， 每個稀釋度取0.1ml涂平板，30°C恒溫培養24h。挑選突變單菌落，分別檢測突變菌株在 PH4.0條件下的反硝化能力，經篩選獲得誘變菌株KD203-3,即得到保藏號為CGMCC No . 11624的枯草芽孢桿菌。該誘變菌株KD203-3能在30 °C，轉速120rpm條件下，培養4d，對 PH4.0的硝酸鹽葡萄糖反硝化液體培養基中硝酸鹽氮的去除率達到88%。
[0013] 對本發明的枯草芽孢桿菌KD203-3在形態、16S rDNA基因序列和生理生化方面進 行鑒定。
[0014] 試驗1:對耐酸反硝化的枯草芽孢桿菌KD203-3的形態進行鑒定。
[0015]將枯草芽孢桿菌KD203-3接種于LB培養基上，培養24小時后的培養性狀為:枯草芽 孢桿菌KD203-3產生芽孢，芽孢大多數為近端生、少數為中生，孢子囊膨大不明顯;LB(細菌 基礎培養基)培養基平皿上菌落呈不規則圓形狀、表面不平整、乳白色、膜質，不透明、表面 暗色。
[0016] 經革蘭氏染色，枯草芽孢桿菌KD203-3的形態為:革蘭氏陽性，桿狀、兩端鈍園，少 數呈不同程度鏈狀排列。
[0017] 實驗2:對枯草芽孢桿菌KD203-3的16S rDNA基因序列進行鑒定。采用天根生化科 技(北京)有限公司基因組DNA提取試劑盒提取該菌株的基因組DNA，然后以提取的總DNA作 為模板。擴增引物為通用引物，將PCR(聚合酶鏈反應)產物送寶瑞通生物技術(北京)有限公 司測序分析。將測序結果進行同源性比較，比較結果表明，枯草芽孢