一種防治真菌病的黑木耳菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物病害生物防治技術領域，具體涉及一種防治真菌病的黑木耳菌及 其應用。
【背景技術】
[0002] 蔬菜是人們日常飲食中必不可少的食物之一。蔬菜可提供人體所必需的多種維生 素和礦物質等營養物質。灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)引起的灰霉病是一種世界 性真菌病害，該病已在全國各地普遍發生，且呈上升趨勢，成為當前蔬菜生產上的重要病 害。灰霉病菌寄主范圍十分廣泛，可侵染番茄、生菜、茄子、黃瓜、辣椒、草莓、葡萄、大蒜和柑 橘等400多種作物，對蔬菜、果樹及花卉等多種作物產生危害，在保護地果蔬生產中尤為突 出。灰霉病自20世紀80年代開始在我國發生和蔓延，其傳播速度快，對我國蔬菜生產具有極 大的威脅，嚴重時可減產40 %~50%，甚至絕產。
[0003] 灰霉病在生產上已成為一類重要的頑固性病害，控制該病害的發生與蔓延是確保 作物產量與品質而急需解決的問題。目前灰霉病的防治主要有以下3種方法，即生態防治、 化學防治和生物防治。
[0004] 栽培抗灰霉病的作物品種是一種重要的控制灰霉病病害發生的農業措施，但迄今 為止市面上尚未有能投入生產應用的抗灰霉病作物品種。由于目前已報告的灰霉病抗性資 源稀少，且大部分為多基因控制的復雜數量性狀，灰霉病的抗病育種工作一直進展緩慢。
[0005] 長期以來，我國農作物的病蟲害防治主要依賴化學農藥，農藥污染較為嚴重，食品 中農藥檢出率高達90%以上，這嚴重危害了消費者的身體健康。同時，由于食品農藥殘留問 題導致我國農產品出口受阻，這對我國現代農業產業的發展構成了嚴重影響。因此，農藥殘 留已成為食品安全生產中急需解決的問題。相比化學農藥，生物農藥具有安全、環保和無殘 留等優點。注重低毒、高效和選擇性強的生物農藥開發已成為當前的研究熱點之一。
[0006] 目前，許多研究者提倡并在重點研究開發利用生物防治技術來控制灰霉病害。生 物防治措施既對環境友好，對人畜安全，又能有效控制病害的發生與蔓延所以頗受青睞。目 前已報告的灰霉病菌詰抗細菌主要集中于芽孢桿菌（Bacillus spp.)、鏈霉菌 (Streptomyces spp.)、假單胞菌(Pseudomonas spp.)等，對灰霉病生防效果較好的生防真 菌主要有木霉（Trichoderma spp·)、粉紅粘帚霉（Gliocladium roseum)和酵母菌 (Yeasts)。李小龍等發現淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)的發酵產物對灰葡萄孢菌 有抑菌作用，且對番茄植株存在一定的促生效果，是一種新的防治番茄灰霉病的真菌生防 因子。
[0007]至今關于絲狀擔子菌作為生防菌的報道較少，劉標等發現采絨革蓋菌能夠降解菊 粉;李國紅首次發現擔子菌YL 14具殺線蟲活性；肖逸等角擔子菌B6的活菌絲能夠改善土壤 環境，提高西瓜植株的抵抗力，進而增加產量。有關絲狀擔子菌作為生防菌的報道更少，用 其防治灰霉病暫未出現任何報道。
【發明內容】
[0008] 本發明的第一個目的是提供一種黑木耳菌DK6(本發明或稱為DK6菌株），該菌株對 灰霉菌有較強的防治效果。該菌株已于2016年1月18日送至中國典型培養物保藏中心保藏， 分類命名：Auricularia auricula-judae DK6;保藏編號：CCTCC Ν0:Μ 2016054;地址：中國 武漢武漢大學。
[0009] 本發明的第二個目的是在于提供了一種黑木耳菌DK6在制備治療或預防真菌病生 物制劑藥物中的應用，特別適合于植物灰霉病的防治。
[0010] 本發明最后一個目的在于提供了一種黑木耳菌DK6在促進番茄生長中的應用。 [0011]為了達到上述目的，本發明采用以下技術措施：
[0012] 一種黑木耳菌DK6,通過以下方式獲得：
[0013] 申請人從中國湖北省十堰市玉米葉片上分離、篩選得到一株對灰霉病具有較強防 治效果的菌株，將其命名為DK6。通過形態學及分子生物學的鑒定，鑒定為擔子菌木耳屬 (Auricularia spp.)。該菌株已于2016年1月18日送至中國典型培養物保藏中心保藏，分類 命名：Auricularia auricula-judae DK6;保藏編號：CCTCC Ν0:Μ 2016054;地址：中國武漢 武漢大學。
[0014] DK6菌株菌落特征:菌落整體呈現白色。隨著培養時間的增長，正反顏色出現不同， 正面菌絲顏色逐漸變黃，且密布菌絲，菌絲與培養基結合不牢固，而背面出現淡黃色。隨著 時間的延長，淡黃色慢慢加深。菌絲無色，有隔膜，呈樹枝狀，分支菌絲互生，分支處有溢縮 但不明顯，與主枝菌絲角度小于90°C，菌絲末端鈍圓；目前尚未觀察到其孢子。
[0015] 平板培養DK6使用的是TOA培養基，該培養基組分及配方如下：馬鈴薯200g，葡萄糖 20g，瓊脂20g，補充蒸餾水至1000mL，調pH至7.0，在121 °C高壓蒸汽滅菌30min; 25°C，暗培 養。
[0016] -種黑木耳菌DK6在制備治療或預防真菌病生物制劑藥物中的應用，包括利用該 菌株作為有效成分之一制備成防治植物灰霉病的藥物，所述的黑木耳菌DK6特別適用于防 治番茄灰霉病和生菜灰霉病。
[0017] 以上所述的應用，本發明的保護內容還包括，黑木耳菌DK6的發酵產物在制備灰霉 菌孢子萌發抑制劑中的應用。
[0018] 本發明的保護內容還包括黑木耳菌DK6在制備灰霉菌抑制劑中的應用。
[0019] -種黑木耳菌DK6在促進番茄生長中的應用，包括所述的黑木耳菌DK6發酵液用于 制備番茄促生長制劑。
[0020] 與現有技術相比，本發明具有以下優點：
[0021] 1.本發明篩選出一株防治灰霉病的新菌株DK6,該菌株是擔子菌木耳屬，目前沒有 關于該菌株防治灰霉病的相關報道。
[0022] 2.用該真菌的發酵液，能有效地抑制灰霉病的發生和蔓延。本發明篩選出的DK6菌 株對灰霉菌在平板拮抗試驗中，DK6能夠覆蓋到灰霉菌上繼續生長，初步判定其與灰霉菌是 競爭作用，為一株較好詰抗活性的菌株;在尚體葉片試驗中，DK6菌株發酵液對灰霉病的防 效可達80%，能夠有效地阻止病斑的擴展；室內盆栽試驗結果表顯示，DK6處理組的病斑均 較小，病情指數較小，防效可達57 %。生菜灰霉病田間防效(病情穩定期)結果表明，DK6發酵 液處理組對灰霉病的防效高達73%，防效較高。
[0023] 3 .DK6發酵液對番前種子的萌發試驗中，DK6發酵液和DK6發酵產物對番前種子的 萌發沒有促進作用;DK6發酵液對番茄生長的試驗中，DK6菌株對番茄有較好的促生作用，在 莖粗、株高、根長、鮮重、干重方面均與對照組有差異顯著(5%水平上）。
[0024] 4.本發明使用的菌株對番茄灰霉病防效較高，對人畜無毒;成本低;另外也適合對 生采灰霉病的防治。
[0025] 5.本發明利用黑木耳菌DK6菌株的發酵液直接防治番茄灰霉病和生菜灰霉病，生 產和使用均十分簡單，生產中沒有用到有機溶劑，降低了生產過程中和產品中的污染，也不 會產生溶劑中毒，具有生物農藥對人畜安全的優點。
【附圖說明】
[0026]圖1為本發明分離篩選的DK6菌株的菌落形態。
[0027]圖2為本發明分離篩選的DK6菌株的顯微圖片，100倍鏡下的圖片。
[0028]圖3為本發明分離篩選的DK6菌株的rDNA-ITS區擴增序列電泳圖。
[0029]方框內是DK6菌株的擴增序列。
[0030] 圖4為本發明分離篩選的DK6菌株對灰霉病菌株的拮抗作用和對照。
[0031] 其中：4A是對照(未接種DK6菌株），4B顯示了DK6在PDA培養基上對灰霉病菌株的拮 抗作用。
[0032] 圖5為本發明分離篩選的DK6菌株發酵產物對灰霉菌生長速率的影響(3d)示意圖。
[0033] 其中：5A是對照，5B是發酵產物濃度為1 %的抑制結果，5C是發酵產物濃度為5%的 抑制結果，是發酵產物濃度為10 %的抑制結果。
[0034] 圖6為本發明分離篩選的DK6菌株發酵產物對灰霉菌生長速率的影響(7d)示意圖。
[0035] 其中：6A是對照，6B是發酵產物濃度為1 %的抑制結果，6C是發酵產物濃度為5%的 抑制結果，6D是發酵產物濃度為10 %的抑制結果。
[0036] 圖7為本發明分離篩選的DK6菌株發酵產物對灰霉菌菌絲的影響，100倍鏡下的結 果圖。
[0037]其中：7A是對照（不含DK6發酵產物的PDA培養基上灰霉菌菌絲的形態）；7B顯示了 含有DK6發酵產物的PDA培養基上灰霉菌菌絲的形態;7C顯示了含有DK6發酵產物的PDA培養 基上灰霉菌菌絲的形態。
[0038]圖8為本發明分離篩選的DK6菌株發酵產物對灰霉菌孢子的影響示意圖。
[0039] 其中：8A是對照(未經DK6發酵產物處理，無菌水處理）；8B顯示了經DK6發酵產物處 理的灰霉菌孢子萌發情況。
[0040] 圖9為本發明分離篩選的DK6菌株發酵產物對灰霉菌孢子萌發和芽管長度影響的 柱狀圖。
[0041] 圖10為離體葉片條件下DK6菌株對番茄灰霉病的抑制作用示意圖。
[0042] 其中：10A是對照(未經DK6發酵液處理，無菌水處理），10B顯示了DK6發酵液對番茄 灰霉病的抑制作用。
[0043]圖11為盆栽試驗中DK6菌株對番茄灰霉病的防效示意圖。
[0044] 其中：11A是對照(未經DK6發酵液處理，無菌水處理）；11B顯示了DK6發酵液對番茄 灰霉病