凝膠電泳檢測，并切膠回收目的片 段。
[0047] 將得到編碼本發明所提供的抗前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體的雙酶切基 因片段克隆連接到表達載體pET_28a，經測序驗證后，得到重組質粒。
[0048]重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(Rosseta)中，并挑取單菌落進行誘導表達。將單菌 落接種于LB培養基的試管中，37°C振蕩培養，過夜活化;次日，按1 %的比例轉接于新鮮的LB 液體培養基中，37 °C、250rpm振蕩培養，至0D6QQ約為0.6后，加入終濃度為0.1 mM的IPTG，37 °C、250rpm誘導4h。
[0049] 上述誘導的2mL菌液通過8000rpm離心得到菌體，菌體使用無菌roS洗滌3次，并用 lmL無菌PBS進行重懸菌體，冰上超聲破碎菌體直至菌液清亮，在4°C下對細胞裂解液進行離 心，離心條件為12000rmp/min，時間為10min，取上清加入5μ1 5XSDS上樣緩沖液，沸水煮沸 5min，離心后取上清液進行SDS-PAGE電泳分析并采用鎳柱對其進行純化。
[0050] 通過優化誘導表達條件（如宿主菌、表達載體、誘導時間、誘導溫度及IPTG濃度 等），可以進一步提高目的蛋白（單域重鏈抗體)的表達量，為大量制備抗前列腺特異性膜抗 原的單域重鏈抗體提供了途徑。
[0051 ] 實施例5
[0052]針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體親和常數的測定 [0053]將實施例4中表達的單域重鏈抗體采用生物素化試劑盒進行生物素化標記，其后 使用標準的競爭性ELISA技術測定生物素化針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體與實 施例1中重組表達的PSMA蛋白親和能力。具體步驟為:首先采用InM生物素化的針對前列腺 特異性膜抗原的單域重鏈抗體分別與13種不同濃度(0.1 nM~100μΜ)的PSMA抗原在EP管中 進行30min孵育;其后，將90yL混合液加入已使用3 %BSA-PBST封閉的、包被有PSMA蛋白的酶 標板中，孵育l〇min后，吸棄反應液，并用PBST清洗;接著，加入100yL稀釋度為1: 2000HRP標 記的鏈霉親和素，孵育lh后采用PBST清洗5次;TMB工作液的使用和0D45Q的測定同實施例2。 采用非線性回歸分析得到〇D 45Q最大值一半時，對應的PSMA濃度，根據抗原-抗體競爭性結合 實驗的原理得出生物素化的針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體親和常數為5 X ΚΓ7/ Μ左右。
[0054]實施例6免疫親和吸附材料的制備 [0055] 1、免疫親和磁珠的制備
[0056] 采用納米磁珠作為載體，偶聯針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體后，得到 針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體免疫磁珠，具體制備方法如下：
[0057] 取lmg羧基修飾的磁珠(購自無錫百運納米科技有限公司，羧基磁珠300nm)于離心 管中，加入500μ1活化緩沖液(1 OmM，NaH2P〇4，pH 6.0)，渦旋混合均勻，磁力架回收磁珠，再用 活化緩沖液洗滌2遍。分別加入2mg碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，渦旋混合后， 靜置30min。用偶聯緩沖液（10mM，Na 2HP〇4，pH 7.4)洗滌磁珠3遍，加入溶于偶聯緩沖液的針 對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體lmg，室溫反應3h，用偶聯緩沖液洗滌磁珠3次，加入 500μ1含l%(w/v)牛血清白蛋白（BSA)或1% (w/v)卵清蛋白（0VA)的偶聯緩沖液封閉未反應 的活性基團，室溫反應30min。用偶聯緩沖液洗滌磁珠3次，PBS溶液（10mM，pH7.4，0.02%w/ v，Na3N)重懸后保存于4°C。
[0058] 2、針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體免疫親和吸附材料及親和柱的制備。 采用瓊脂糖微球作為載體，偶聯前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，具體制備方法如下： [0059] 將CNBr活化的干膠用0.1M HC1洗滌10次，每次平衡5min。用偶聯緩沖液（10mM， Na2HP〇4，pH 7.4)洗滌10次，加入針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體(2mg/每克瓊脂 糖微球），室溫反應4h，使針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體與CNBr活化的瓊脂糖凝 膠微球共價偶聯。用偶聯緩沖液（1 OmM，Na2HP〇4，pH 7.4)洗滌2次后，加入封閉液室溫反應2h 以封閉未反應的活性基團。用5倍膠體積的磷酸緩沖液（10mM，pH 7.4)和醋酸緩沖液(0.謂， pH 4.0)交替洗滌3次，得到共價偶聯了針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體的免疫親 和吸附材料。取0.2ml上述免疫親和吸附材料于容量為lml的層析柱，5~10倍柱床體積的 PBS (1 OmM，pH 7.4)洗滌后，加入20 %乙醇溶液，4 °C保存。
[0060] 3、針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體免疫親和吸附材料及親和柱的制備。 采用硅膠微球作為載體，偶聯抗前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，具體制備方法如下： [0061 ] 取2g硅膠微球用純水和磷酸緩沖液(PBS，10mM，pH 6.0)交替洗滌5~10次，用10ml PBS緩沖液懸浮硅膠微球，加入5mg針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，混勻，加入終 濃度5mg/ml的碳二亞胺(EDC)，迅速混勻，4°C攪拌反應12~24h，得到共價偶聯了針對前列 腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。取〇.2ml上述免疫親和吸附材料于 容量為lml的層析柱，5~10倍柱床體積的PBS(10mM，pH 6)洗滌后，加入含0.02%(w/v)Na3N 的PBS(10mM，pH 6)，4°C保存。
[0062]本發明針對前列腺特異性膜抗原的免疫親和吸附材料配基為單域重鏈抗體，具有 SEQ ID N0. :1所示的氨基酸序列，該配基可特異性識別前列腺特異性膜抗原。該單域重鏈 抗體容易獲得、吸附效率高，可以通過生物學方法大量培養生產配基為單域重鏈抗體，避免 了人工抗體等繁瑣生產方法，大大降低了生產成本。具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產等特 性，這些特性對于前列腺特異性膜抗原的低成本、可重復使用的純化及免疫學檢測方法有 重要的實用價值。
【主權項】
1. 針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列。2. -種核酸分子，其特征是編碼權利要求1中所述氨基酸序列。3. 根據權利要求2所述的核酸分子，其特征在于序列如SEQ ID NO.:2。4. 一種包含權利要求2所述的核酸序列的載體。5. -種包含權利要求4所述的載體的宿主細胞。6. 權利要求1所述的針對前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體在免疫檢測、菌體或抗原 富集純化中的應用。7. 權利要求1所述的針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體在制備前列腺特異性膜 抗原免疫檢測、富集以及純化試劑或材料中的應用。8. 權利要求1所述的針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體通過隨機或定點突變技 術進行改造所獲得的能與前列腺特異性膜抗原特異性結合的抗體。9. 一種針對前列腺特異性膜抗原的免疫親和吸附材料，包括載體，搭載在載體上的配 基，其特征在于該材料以針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體作為配基，所述針對前 列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體具有SEQ ID NO.: 1所示的氨基酸序列。
【專利摘要】本發明屬于基因工程領域，具體為針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，其具有SEQ？ID？NO.:1所示的氨基酸序列，可用于免疫檢測、抗原富集純化等領域。本發明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術進行改造，能夠獲得性質（親和性、特異性、穩定性等）更好的突變體，用來發展進一步用于醫藥、工業、農業的蛋白質或多肽。
【IPC分類】B01J20/24, C07K1/14, C07K16/30, C07K14/47, C12N15/13, G01N33/574, G01N33/68
【公開號】CN105622755
【申請號】CN201610074011
【發明人】范校周, 郭燕麗
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年2月3日