降鈣素原單克隆抗體對及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物領域，特別是涉及降鈣素原(PCT)單克隆抗體對、其制備方法及其 在降鈣素原檢測中的應用。
【背景技術】
[0002] 降鈣素原(PCT)是由116個氨基酸組成的激素原，是一種分子量約為13KD的糖蛋 白，在正常生理情況下，由甲狀腺C細胞分泌產生，在體內半衰期為25~30個小時。PCT由神 經內分泌細胞(包括甲狀腺、肺和胰腺組織的C細胞)表達，經酶切分解為(未成熟）降鈣素、 羧基端肽和氨基端肽。健康人血液中的PCT濃度非常低，小于0.05ng/ml。在炎癥刺激特別是 細菌感染/膿毒血癥狀態下，機體各個組織、多種細胞類型均可產生PCT，并釋放進入血液循 環系統。因此通過測量人體血清中PCT的含量，可以鑒別細菌感染程度。
[0003] 動物模型試驗顯示機體發生膿毒血癥時，多組織均能表達PCT。膿毒血癥患者體內 的PCT只含有114個氨基酸，缺少氨基末端的Ala-Pro 1CT水平升高見于細菌性膿毒血癥，尤 其是重癥膿毒血癥和感染性休克。PCT可作為膿毒血癥的預后指標，也是急性重癥胰腺炎及 其主要并發癥的可靠指標。2012年9月發表的《降鈣素原PCT急診臨床應用的專家共識》指 出：膿毒癥患者的PCT水平明顯高于非膿毒癥患者。且PCT升高對細菌感染導致的膿毒癥特 異性很高，可作為診斷膿毒癥和鑒別嚴重細菌感染的生物標志物。同時，與單純的臨床檢測 標準相比，PCT檢測可顯著提高SIRS/膿毒癥診斷的敏感性(97% )和特異性(78% )。把PCT加 入診斷標準后，診斷準確率從0.77提高到0.94。
[0004] 對于社區獲得性呼吸道感染和空調誘導性肺炎患者，PCT可作為抗生素選擇以及 療效判斷的指標，因此發明降鈣素原(PCT)體外診斷試劑配對抗體原料對于臨床診斷具有 重大的社會價值和經濟價值。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題之一是提供一對降鈣素原單克隆抗體對，它可以提高降 鈣素原體外檢測的準確性。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明的降鈣素原單克隆抗體對，包括檢測抗體和捕獲抗 體;所述檢測抗體的重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示； 所述捕獲抗體的重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.9 所示，輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。
[0007] 本發明要解決的技術問題之二是提供上述降鈣素原單克隆抗體對的制備方法。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明的降鈣素原單克隆抗體對制備方法，步驟包括：
[0009] 1)制備降鈣素原重組抗原；
[0010] 2)制備小鼠降鈣素原單克隆抗體；
[0011] 3)高通量篩選降鈣素原單克隆檢測抗體和捕獲抗體對。
[0012] 較佳的，步驟1)，采用293F真核表達系統獲得降鈣素原重組抗原。
[0013] 較佳的，步驟3)，采用酶聯免疫化學發光檢測方法篩選降鈣素原單克隆抗體對。
[0014] 本發明要解決的技術問題之三是提供上述單克隆抗體對在降鈣素原檢測中的應 用。
[0015] 較佳的，可以采用酶聯免疫化學發光檢測方法進行降鈣素原的檢測。
[0016] 本發明通過建立酶聯免疫化學發光檢測(ELISA)平臺，篩選降鈣素原最佳配對抗 體，這種篩選方法不僅減少了后期純化工作，而且提高了 PCT體外診斷試劑的產品質量，用 篩選得到的降鈣素原最佳配對抗體對可以有效地體外檢測人體血清或血漿中的PCT含量， 提高細菌感染診斷的準確性。
【附圖說明】
[0017] 圖1是蛋白純化結果圖。
[0018] 圖2是3只小鼠免疫血清檢測結果圖。
[0019] 圖3是陽性血清檢測二次亞克隆結果。其中，第一次稀釋倍數5倍，第二次稀釋倍數 10000倍，暴露時間3分鐘。孔板A-E排5個陽性PCT血清的濃度分別為:A:18.41ng/ml，B: 6 · 99ng/ml，C: 19 · 66ng/ml，D:0 · 829ng/ml，E: 1 · 5ng/ml。孔板F排為濃度0 ·82mg/ml的重組 PCT蛋白，G排為濃度100ng/ml的重組PCT蛋白，孔板Η排為PBS(磷酸鹽緩沖液）。
[0020] 圖4是l-d(l作為捕獲抗體，d作為檢測抗體)配對檢測結果。最低檢測限0.1ng/ml。 [0021 ]圖5是使用最佳配對抗體對的酶聯免疫ELISA檢測方法的標準曲線。
【具體實施方式】
[0022]為對本發明的技術內容、特點與功效有更具體的了解，現結合附圖及具體實施例， 對本發明詳述如下：
[0023] 實施例1
[0024] 一、PCT抗原設計和表達
[0025] 1.PCT抗原氨基酸序列（SEQ ID N0.1):
[0026] APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQNYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRSKRCGNLSTCMLGTYTQDFNK FHTFPQTAIGVGAPGKKRDMSSDLERDHRPHVSMPQNAN
[0027] 堿基序列（SEQ ID NO.2):
[0028] GCTCCTTTCCGCAGCGCTCTCGAATCTAGCCCCGCCGACCCAGCTACACTGTCCGAGGACGAGGCTAGACTGCTGCT GGCCGCCCTGGTGCAGAACTATGTACAGATGAAGGCTTCTGAGCTGGAGCAGGAACAAGAGCGGGAGGGGTCGAGCC TCGACTCTCCTAGATCGAAGCGGTGCGGAAACCTGTCTACCTGTATGCTCGGAACATACACCCAGGACTTCAACAAG TTCCACACATTCCCTCAGACAGCTATTGGCGTGGGCGCTCCCGGCAAGAAGCGCGACATGTCTTCTGACTTAGAAAG AGACCACCGGCCTCACGTTTCCATGCCACAGAACGCCAAC
[0029] 2.表達系統
[0030] 采用293F真核系統表達。
[0031] HEK 293細胞表達的重組蛋白具有準確的轉錄后修飾功能，表達的糖基化藥物蛋 白在分子結構、理化特性和生物學功能方面接近于天然蛋白分子。293F現已可采用無血清 懸浮培養，無血清懸浮培養是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細 胞培養方式，它能減少后期純化工作，提高產品質量。
[0032] 3.質粒構建
[0033] 合成基因序列:包括5 '端EcoRI，3 '端Xhol酶切位點，N端添加 Kozak(GCCGCCACC)以 及CD33信號肽序列（ATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCGCTAGCT)，C端添加 His Tag序列（CATCATCACCATCACCAT)以及終止密碼（TGATAG)。并將此序列構建至pcDNA4.0To myc HisA載體。合成的基因序列如下（SEQ ID N0.3):
[0034] gaattcGCCGCCACCATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCGCTAGCTGCTCCTTTCCGCAG CGCTCTCGAATCTAGCCCCGCCGACCCAGCTACACTGTCCGAGGACGAGGCTAGACTGCTGCTGGCCGCCCTGGTGC AGAACTATGTACAGATGAAGGCTTCTGAGCTGGAGCAGGAACAAGAGCGGGAGGGGTCGAGCCTCGACTCTCCTAGA TCGAAGCGGTGCGGAAACCTGTCTACCTGTATGCTCGGAACATACACCCAGGACTTCAACAAGTTCCACACATTCCC TCAGACAGCTATTGGCGTGGGCGCTCCCGGCAAGAAGCGCGACATGTCTTCTGACTTAGAAAGAGACCACCGGCCTC ACGTTTCCATGCCACAGAACGCCAACCATCATCACCATCACCATTGATAGctcgag
[0035] 4.質粒提取、蛋白表達、蛋白純化與檢測
[0036]用真核表達載體大量提取無內毒素質粒(Max Extract)。將所提取的無內毒素質 粒進行細胞轉染。收集細胞上清及細胞裂解液，采用Ni柱親和層析，收集樣品進行SDS-PAGE Westernblot檢驗，濃度檢測，將合格樣品（純度>90%)透析至PBS(磷酸鹽緩沖液），并將蛋 白濃縮至>1 .〇mg/ml，蛋白純化結果如圖1所示。
[0037]二、免疫與采血
[0038] 1)選取3只BALB/c小鼠（雌性，6周齡以上)進行免疫。
[0039] 2)第0周：免疫前，小鼠眼眶靜脈采血50μ1/只，37°C放置lh后，以5000rpm離心 5min，制備陰性血清，-20°C保存。進行小鼠第一次免疫，抗原劑量為100yg/只，弗氏完全佐 劑(Sigma-F5881)，分多點皮下注射。
[0040] 3)第2周：小鼠第二次免疫，抗原劑量為50yg/只，不完全佐劑(Sigma-F5506)，注射 方式與劑量同初次免疫。
[0041 ] 4)第4周:小鼠第三次免疫，免疫劑量和免疫方法同第二次免疫。
[0042] 5)第5周：小鼠眼眶靜脈采血50μ1/只，37°C放置lh后，以5000rpm離心5min，制備血 清，進行ELI SA檢測，檢測結果如圖2所示。剩余血清-20