一種單克隆抗體q314及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種單克隆抗體Q314及應用。
【背景技術】
[0002] 埃博拉病毒是迄今為止人類所知的最致命傳染性病毒之一，平均病死率高達50% 左右。由于埃博拉出血熱的高致死率，以及目前尚未有任何預防或治療方法可在臨床上廣 泛使用。埃博拉病毒被列為生物安全第四級(Biosafety Level 4)病毒，同時被視為是生物 恐怖主義的工具之一。
[0003] 2014春季年開始在西非各國暴發的埃博拉疫情引起了全世界的廣泛關注。截止至 2015年2月27日，埃博拉病毒確診和疑似病例已經達到23825人，死亡人數達到9660人，美國 和一些歐洲國家已經有輸入性的傳播，并有死亡病例。因此，防控埃博拉病毒是全球所有國 家的頭等大事。然而令所有人焦慮的是:到目前為止還沒有一個被批準的埃博拉病毒疫苗 和藥物上市。由美國和加拿大聯合開發的應急性治療藥物ZMapp是目前唯一在模式動物和 小規模病人臨床驗證有效的藥物。我國目前尚沒有類似的應急藥物，一旦有中國公民感染 埃博拉病毒，后果不堪設想。緊急研制埃博拉病毒抗體對于我國乃至全球埃博拉病毒疫情 的防控具有重要的意義，同時對社會的穩定和諧有著深遠的影響。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種單克隆抗體Q314及應用。
[0005] 本發明保護的單克隆抗體Q314，為一種IgG抗體，由輕鏈和重鏈組成;所述重鏈中 的重鏈可變區中的⑶R1、⑶R2和⑶R3依次為序列表的序列3自N末端第45-52位氨基酸殘基、 第70-77位氨基酸殘基和第116-135位氨基酸殘基；所述輕鏈中的輕鏈可變區中的CDR1、 CDR2和CDR3依次為序列表的序列5自N末端第45-52位氨基酸殘基、第70-72位氨基酸殘基和 第109-121位氨基酸殘基。
[0006] 所述重鏈可為如下（a)或(b): (a)序列表的序列3自N末端第20-474位氨基酸殘基 組成的蛋白質；（b)序列表的序列3所不的蛋白質。
[0007] 所述輕鏈可為如下（C)或(d):(c)序列表的序列5自N末端第20-234位氨基酸殘基 組成的蛋白質；（d)序列表的序列5所不的蛋白質。
[0008] 本發明還保護編碼所述IgG抗體的基因，其特征在于：
[0009]編碼所述重鏈的基因為如下（1)或(2)或(3):
[0010] ⑴序列表的序列4自5'末端第889-2313位核苷酸所示的DNA分子；
[00?1 ] (2)序列表的序列4自5'末端第946-2313位核苷酸所不的DNA分子；
[0012] (3)序列表的序列4所示的DNA分子；
[0013] 編碼所述輕鏈的基因為如下(4)或(5)或(6):
[0014] (4)序列表的序列6自5'末端第889-1593位核苷酸所不的DNA分子；
[0015] (5)序列表的序列6自5'末端第946-1593位核苷酸所示的DNA分子；
[0016] (6)序列表的序列6所示的DNA分子。
[0017] 本發明還保護所述IgG抗體在制備用于抑制埃博拉病毒扎伊爾亞型的藥物中的應 用。
[0018] 本發明還保護一種用于抑制埃博拉病毒扎伊爾亞型的藥物，其活性成分為所述 IgG抗體。
[0019] 本發明還保護所述IgG抗體在制備用于中和埃博拉病毒扎伊爾亞型的藥物中的應 用。
[0020] 本發明還保護一種用于中和埃博拉病毒扎伊爾亞型的藥物，其活性成分為所述 IgG抗體。
[0021] 本發明還保護所述IgG抗體在制備用于預防和/或治療埃博拉病毒扎伊爾亞型引 起的埃博拉出血熱的藥物中的應用。
[0022] 本發明還保護一種用于預防和/或治療埃博拉病毒扎伊爾亞型引起的埃博拉出血 熱的藥物，其活性成分為所述IgG抗體。
[0023]埃博拉病毒扎伊爾亞型又稱扎伊爾埃博拉病毒，英文縮寫為EB0V。
[0024]本發明利用EB0V的GPAm蛋白作為釣餌，從免疫猴的外周血單個核細胞中篩選抗 體生成的記憶B細胞，得到可同GPAm蛋白特異結合的單克隆抗體。通過EB0V假型病毒侵染 模型，篩選得到了具有中和活性同時具有良好的特異性的的單克隆抗體。
[0025]本發明對于扎伊爾埃博拉病毒的防控具有重大的應用價值，將產生深遠的社會意 義。
【附圖說明】
[0026]圖1為抗體對EB0V的中和活性的結果。
[0027]圖2為抗體對VSV的中和活性的結果。
[0028]圖3為抗體對HIV的中和活性的結果。
[0029]圖4為抗體對SUDV的中和活性的結果。
【具體實施方式】
[0030] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0031] 質粒PCDNA3 · 1 ( + ): Invi trogen公司，產品目錄號V790-20。293T細胞：蓋德，CRL-11268。恒河猴:藍島生物。PMD18T載體:Takara，產品目錄號DlOlAJeroEe細胞:vircell公 司，產品目錄號VCV6。
[0032] 質粒pNL4-3R-E-luciferase(骨架質粒）：參考文獻：He J，Choe S，Walker R，Di Marzio P,Morgan D0,Landau NR.J Virol 69:6705-6711,1995.〇
[0033] 實施例1、抗體的發現
[0034] 一、GP Am蛋白的制備
[0035] 1、構建重組質粒
[0036] (1)合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0037] 序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子編碼序列表的序列1所示的蛋白質，其中開放 閱讀框為序列2自5'末端第18-1451位核苷酸。序列表的序列1中，自N末端第1至19位氨基酸 殘基組成信號肽，第472至477位氨基酸殘基組成His 6標簽。序列表的序列1所示的蛋白質的 預期分子量為200kDa。
[0038] (2)用限制性內切酶BamHI和Not I雙酶切步驟1得到的雙鏈DNA分子，回收酶切產 物。
[0039] (3)用限制性內切酶BamHI和Notl雙酶切質粒pcDNA3.1( + )，回收約5400bp的載體 骨架。
[0040] (4)將步驟2回收的酶切產物和步驟3回收的載體骨架連接，得到重組質粒 pcDNA3.1 -GP Am。根據測序結果，對重組質粒pcDNA3.1 -GP Am進行結構描述如下：在質粒 pcDNA3.1 ( + )的BamHI和No t頂每切位點之間插入了序列表的序列2自5 '末端第11至1453位核 苷酸所示的雙鏈DNA分子。
[0041 ] 2、構建重組細胞
[0042]將步驟1得到的重組質粒轉染293T細胞，得到重組細胞。
[0043] 3、制備GP Am蛋白
[0044] (1)取步驟2得到的重組細胞，在含2 %胎牛血清的DMEM培養基培養72h，然后 4000rpm離心30min，收集上清液。
[0045] (2)親和層析
[0046]親和層析的層析柱規格:長度3cm，內徑lcm;
[0047] 親和層析的柱填料:鎳柱beads(購自Qiagen公司，產品目錄號為30230);
[0048]操作步驟:①將300mL步驟（1)得到的上清液上樣于親和層析柱，4°C孵育3小時;② 用100mL含20mM咪唑的上樣緩沖液洗滌柱子;③用30mL含500mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的 蛋白，收集過柱后溶液。上樣緩沖液即HEPEs buffer。
[0049] (3)取步驟(2)得到的過柱后溶液，用30kD濃縮管（購自Merck公司，產品目錄號為 UFC800396)進行濃縮，得到體積為lml的濃縮液。
[0050] (4)凝膠過濾層析
[0051]凝膠過濾層析的層析柱規格:長度24cm，內徑2cm;
[0052]凝膠過濾層析的柱填料：superdex200increase 10/300GL(購自 GEHealthcare公 司，產品目錄號為28-9909-44);
[0053] 操作步驟：上樣0.5ml步驟（3)得到的濃縮液，用流速為0.5ml/min的PBS緩沖液 (pH7.2、10mM)洗脫，收集保留體積為1 lml的峰對應的過柱后溶液，即為GPAm蛋白溶液。 [0054] 二、從與GPAm蛋白特異結合的menory B細胞中分離抗體可變區基因
[0055] 1、將GPAm蛋白作為免疫原免疫恒河猴，然后取外周血并分離單個核細胞(PBMC)。
[0056] 2、采用流式細胞儀分選能夠特異性識別GPAm蛋白的B細胞（CD3-CD16-CD235a- CD19+CD27+CD38-IgG+GPAm BCR+)。
[0057] 3、取步驟2得到的B細胞，提取總RNA并反轉錄為cDNA。
[0058] 4、以步驟3得到的cDNA為模板，進行巢式PCR，將PCR擴增產物進行測序。
[0059] 獲得重鏈可變區的核苷酸序列和輕鏈可變區的核苷酸序列。
[0060] 三、獲得抗體基因
[0061] 將重鏈可變區上游與CMV片段、重鏈可變區下游與人IgGl的恒定區以及ployA片 段，進行overlapping PCR，得到可以表達完整重鏈的DNA片段。
[0062] 將抗體輕鏈可變區上游與CMV片段、抗體輕鏈可變區下游與輕鏈κ/λ的恒定區以及 ployA片段，進行overlapping PCR，得到可以表達完整輕鏈的DNA片段。
[0063] Q314全長重鏈的氨基酸序列如序列表的序列3所示，其編碼基因如序列表的序列4 所示。序列表的序列3中，第1至19位氨基酸殘基組成信號肽（引導蛋白分泌到細胞外），第20 至144位氨基酸殘基組成重鏈可變區，第145至474位氨基酸殘基組成重鏈恒定區。序列表的 序列4中，第1至888位核苷酸組成CMV啟動子，第889至2313位核苷酸編碼序列表的序列3所 示的全長重鏈，第2314至2511位核苷酸為ployA片段。
[0064] Q314全長輕鏈的氨基酸序列如序列表的序列5所示，其編碼基因如序列表的序列6 所示。序列表的序列5中，第1至19位氨基酸殘基組成信號肽（引導蛋白分泌到細胞外），第20 至128位氨基酸殘基組成輕鏈可變區，第129位至234位氨基酸殘基組成輕鏈恒定區。序列表 的序列6中，第1至888位核苷酸組成CMV啟動子，第889至1593位核苷酸編碼序列表的序列5 所示的全長輕鏈，第1594至1741位核苷酸為ployA片段。
[0065]實施例2、抗體的制備 [0066] 一、重組質粒的構建
[0067] 將序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子插入PMD18T載體，得到重鏈表達載體。
[0068] 將序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子插入PMD18T載體，得到輕鏈表達載體。
[0069] 二、重組細胞的構建
[0070]將重鏈表