一種vWF活性保護液的制作方法【
技術領域：
】[0001]本發明涉及一種從人血漿冷沉淀提取凝血因子珊的廢料中提取人血管性血友病因子的制備工藝，特別涉及一種vWF活性保護液，屬于生物制藥領域。【
背景技術：
】[0002]vWF是一種具有多聚體的血漿糖蛋白，其分子量從250kDa到2千萬kDa不等，形成血漿中已知的最大分子量可溶性蛋白。血漿中小分子量vWF主要是二聚體形式，分子量約500kDa。大小不等的多聚體，對維持vWF正常生物活性具有重要意義。[0003]血漿vWF在原發性止血中起著重要作用，其負責血小板與受損傷血管表面的粘附，并因此形成血小板栓子，有助于纖維蛋白交聯的形成。另外，血漿vWF起著凝血因子VIII的運輸劑和穩定劑的作用。[0004]血管性血友病（vWD)是最常見的遺傳性出血性疾病，患者vonWillebrand因子(vonWillebrandfactor，vWF)基因突變或調控異常導致血漿vWF數量減少或質量異常。vWD臨床特征主要為皮膚黏膜出血，2N型和3型患者還可發生與血友病A相似的關節腔出血和肌肉血腫。據國外報道，vWD發病率(2.3~11.0)/10萬人口，一般認為在遺傳性出血性疾病中，vWD居第二位。[0005]臨床上vWF的活性用瑞斯托霉素輔因子活性(vWF:RC〇)來表征，主要用于治療先天性、獲得性血管性血友病(vWD)，一般以20~60UvWF:RCo/kg劑量來給藥。[0006]研究表明冷沉淀中富含vWF等凝血因子類物質。在血漿原料日趨緊缺的今天，通過冷沉淀來制備vWF，對冷沉淀的綜合利用，節約稀缺血漿資源，提高市場競爭力具有重大意義。[0007]現有技術中，較早的工藝使用vWF的抗體偶聯到瓊脂糖凝膠上，通過免疫親和層析純化vWF，但其抗體制備周期長，凝膠載量低，不適合作大規模制備，如《PurificationofvonWillebrandFactorsolutionsusinggelpermeationchromatography》（UP4774323)。[0008]有專利用DEAEFractogelTSK650M(Merck)純化vWF因子組分，純度高，但是工藝比較復雜，需要兩步離子交換和一步親和層析，如《Processforanindustrial-scalepreparationofastandardizedhumanvonWillebrandfactorconcentrateofveryhighpurityandsuitablefortherapeuticuse》（US5408039)。也有報道CHT層析結合PH5.4酸沉淀分離vWF組分的，其比活不高，且酸沉淀去除纖維結合蛋白的同時，可能影響vWF的生物學活性，如《Productionofavonwillebrandfactorprepartionhavingagreatspecificactivity))(US20070135619A1)〇[0009]另外還有一些工藝用EMDFractogelTMAE(Merck)來純化VIII/vWF因子復合物，但是都無法單獨得到高純度的vWF，治療針對性不強，如《具有止血活性的含有vWF的制劑及其制備方法》（CN1425024A)，《AProcessforrecoveringahigh-purityvirus-inactivatedfactorVIIIbyanionexchangerchromatography))(US5714590)〇[0010]還有一些公司用基因重組的方法(猴腎細胞或CHO細胞)純化vWF，他通過陰離子交換層析法從動物細胞培養液中進行提純，但是由于動物原性抗原的存在，人體對其可能有排斥作用，如《MethodforisolationofhighlypurevonWillebrandFactor》（US5854403)。[0011]另有采用兩步層析法純化制備vWF的報道，但其純度不高，比活相對較低，僅50IU/mg，如〈〈Processformanufacturingvonffillebrandfactor))(US5252710)〇[0012]可見，現有的的vWF純化工藝仍存在一些問題：（1)制備周期長，不適應于大規模制備，尤其是采用免疫親和層析法純化時，其抗體制備周期長，凝膠載量低。（2)VIII/vWF復合物產品在較難控制工藝穩定性；（3)重組方法所得vWF產品可能存在異質抗原；（4)分離純化工藝繁瑣。[0013]目前，血管性血友病可用冷沉淀、VIII/VWF因子復合物和DDAVP(1-去氨基-8-D-精氨酸加壓素)治療，但針對性不強，更純的vWF因子可專一性治療各種類型的血管性血友病，與前幾種方法比有較大優勢。【
發明內容】[0014]本發明的目的在于提供一種vWF活性保護液。[0015]本發明的主要技術構思如下：[0016]本發明對經層析后的蛋白液在層析緩沖液中加入甘氨酸保護vWF活性;優選層析后凍干前的蛋白液中加入賴氨酸、甘氨酸和白蛋白作為凍干保護劑，保護vWF活性;優選層析緩沖液中甘氨酸質量濃度0.6%~1%，凍干保護劑中賴氨酸質量濃度2~3%，甘氨酸質量濃度0.2%，白蛋白質量濃度0.8~1.3%。[0017]所述保護液分為洗滌緩沖液B、洗脫緩沖液B和透析液，用Q-Sepharose陰離子交換層析柱進行層析純化時，用洗滌緩沖液B洗滌柱子直至成基線，用洗脫緩沖液B洗脫;在明膠親和層析進行純化時，用洗脫緩沖液B洗滌柱子直至成基線，收集上樣后經層析柱流出來的液體，用透析液透析。[0018]洗滌緩沖液B的配方:4g枸櫞酸鈉，11.4g氯化鈉，3g氯化鈣，6g甘氨酸，加適量注射用水充分溶解，補加注射用水至1L，調節PH為5.8~6.8。[0019]洗脫緩沖液B配方:4g枸櫞酸鈉，16.38g氯化鈉，3g氯化鈣，6g甘氨酸，加適量注射用水充分溶解，補加注射用水至1L，調節PH為5.8~6.8。[0020]透析液的配方:2.94g枸櫞酸鈉，25g氯化鈉，0.11lg氯化鈣，30g甘氨酸，2g鹽酸賴氨酸，人血白蛋白8g，加適量注射用水充分溶解，補加注射用水至1L，調節PH為6.8~7.2。[0021]從冷沉淀提取凝血因子珊的廢料中提取血管性血友病因子的制備工藝，它依次包括:冷沉淀溶解、2%氫氧化鋁凝膠吸附、調節離子強度、串聯過濾、S/D病毒滅活、離子交換層析;離子交換層析得收集洗脫液，洗脫液經超濾、透析、過濾，用于凝血因子VIII的生產，再從冷沉淀提取凝血因子珊的廢料即收集經層析柱流穿出的液體中提取VWF;Q-Sephar〇Se陰離子交換層析、明膠親和層析、除菌過濾分裝、冷凍干燥、干熱滅活。離子交換層析流穿液收集后，先濃縮一倍，再用洗滌緩沖液B等體積超濾6次，再經Q-Sepharose層析柱，用洗脫緩沖液B收集洗脫下來的蛋白液。[0022]從冷沉淀提取凝血因子珊的廢料中提取血管性血友病因子的具體工藝方案如下：[0023](1)檢疫期檢疫合格的人血漿領取后，75%乙醇擦拭血漿袋表面，用注射用水沖洗，合并到融漿罐中，用30~35°C以下循環水融化，血漿溫度控制不高于4°C;待融化后，離心，出液溫度控制在0~4°C，收集冷沉淀；[0024](2)將步驟（1)的制得物加入3IU/ml肝素鈉溶液中，攪拌至冷沉淀完全溶解，循環水的溫度控制在28~37°C;開始離心，收集上清液，稱重；[0025](3)將步驟(2)的制得物上清液用1111〇1/1鹽酸調節?!1至6.0~7.0;加入2%氫氧化鋁凝膠，攪拌;開始離心，收集上清液，稱重；[0026](4)按"W(離子強度緩沖液）=上清液重量/10"計算，稱取計算量的離子強度緩沖液至步驟(3)的制得物上清液中；調節上清液PH至6.0~7.0;用蛋白濃度緩沖液調節蛋白濃度不大于l〇g/L;用1.Ομπι的濾芯過濾，收集過濾液，稱重；[0027](5)按步驟(4)的制得物過濾液體積的1/10加入S/D溶液，攪拌均勻，溫度控制在24~26°C，連續保溫6小時;0.45μπι濾芯過濾;過濾液用30KD超濾膜濃縮至蛋白濃度2%，然后用蛋白液重量的2倍以上洗滌緩沖液Α恒體積超濾，得超濾液，稱重；[0028](6)將步驟(5)的制得物超濾液用離子交換柱進行層析純化，用洗滌緩沖液A洗滌柱子直至成基線，用洗脫緩沖液A洗脫，收集洗脫液(洗脫液經超濾、透析、過濾，用于凝血因子VIII的生產）。[0029](7)收集步驟(6)經層析柱流出來的液體，濃縮一倍，洗滌緩沖液B等體積超濾6次，得超濾液，稱重。[0030](8)將步驟(7)的制得物超濾液用Q-Sepharose陰離子交換層析柱進行層析純化，用洗滌緩沖液B洗滌柱子直至成基線，用洗脫緩沖液B洗脫，收集洗脫液，稱重。[0031](9)將步驟(8)的制得物洗脫液明膠親和層析進行純化，用洗脫緩沖液B洗滌柱子直至成基線，收集上樣后經層析柱流出來的液體，用透析液透析、稀釋至效價l〇〇IU/ml，得蛋白液，稱重。[0032](10)將步驟(9)的制得物蛋白液經0.2μπι除菌濾芯過濾分裝;分裝好的制品傳入凍干柜進行冷凍干燥；出柜扎蓋;99~100°C、30分鐘干熱病毒滅活;送檢，檢驗合格后包裝、入庫。[0033]離子強度緩沖液的配制方法:48.5g三羥甲基氨基甲烷，10g氯化鈣，100g氯化鈉，28.lg甘氨酸，加適量注射用水充分溶解，補加注射用水至1L，調節PH為6.0~7.0;蛋白濃度緩沖液的配制方法:量取0.05L調節離子強度緩沖液，加注射用水至1L，調節PH為6.0~7.0。[0034]洗滌緩沖液A配方:2.5g三羥甲基氨基甲烷，10g氯化鈣，25g氯化鈉，加適量注射用水充分溶解，補當前第1頁1 2