一種從蛋白乳中提取泛素及類泛素的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種從動物或植物中獲取的蛋白乳中提取泛素和類泛素的方法。
【背景技術】
[0002]泛素(ubiquitin)是一種小蛋白，由76個氨基酸組成，分子量大約8500道爾頓。它在真核生物中具有高度保守性。在真核細胞內，泛素以共價鍵結合到底物蛋白質的賴氨酸殘基上，被4個以上泛素標記的蛋白質將被送到“垃圾處理廠”，被26S蛋白酶體識別并迅速降解。近年來，隨著對泛素研究的不斷深入，發現泛素不僅僅是蛋白質降解的標記，還是細胞維持對那些受組成型調節和環境刺激產生的蛋白質水平的基本調節方式，細胞內蛋白質泛素化參與細胞的多種生理過程，比如:細胞周期進程，細胞器的發生，細胞凋亡，細胞增生和分化調節，內質網蛋白質的質控，蛋白轉運，炎癥反應，抗原提呈和DNA修復，以及細胞應激反應等等，在各個生命活動中發揮著重要的作用。
[0003]隨著越來越多的泛素蛋白被報道，各種類似泛素的修飾蛋白也不斷地被發現，如:SUM0、Rubl、Apgs和ApglZ等。類泛素蛋白(Ubls)作為信號使者與類泛素共同控制著多種細胞功能，諸如細胞增殖、凋亡、細胞周期及DNA修復，與泛素在人體自我修復功能系統中扮演著重要的角色。
[0004]泛素及類泛素蛋白有著廣泛的生物學功能，泛素的開發應用價值將逐漸受到重視，從泛素及類泛素的研究中尋找治療腫瘤疾病、心臟病、神經疾病等多種疾病的新途徑將是未來醫學的趨勢之一，泛素及類泛素在植物基因工程技術和提高植物抗逆性等方面的探索及應用將為未來的農業提供新的線索與方向。
[0005]目前，對泛素及類泛素的研究主要集中在作用機理和應用方面，提取純化方面多數局限于對植物或動物的總蛋白的提取，而且提取工藝復雜、成本高，所提取的蛋白質的功能針對性較小，僅局限于補充人體蛋白，所以導致在市場上的競爭性較小。專利CN201410071665.1和專利CN201410071662.8主要是通過分子篩法從總蛋白中提取泛素和類泛素，這種方法雖然可行，但是存在著因為膜材料、膜孔徑等條件的選擇不當而導致泛素和類泛素提取率低或提取不完全的可能。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于，提供一種從動物或植物中獲得的蛋白乳中提取泛素及類泛素的方法，該方法提取步驟少，工藝流程短，操作簡單，且操作過程中不引入不安全物質，減少能源消耗，同時綜合利用動物或植物，適用于工業化生產。
[0007]為此，本發明的技術方案如下:
一種從植物蛋白乳中提取泛素及類泛素的方法，包含如下步驟:
1)將植物熱磨制漿，經離心機處理，得到輕相液為植物油脂，重相液為蛋白乳；
2)將所述蛋白乳置于80?140°C水浴中加熱5?10分鐘后過濾，得到粗提液和沉淀； 3)將所述沉淀用蒸餾水清洗后再次過濾，收集濾液；
4)將所述收集的濾液與所述粗提液合并，加入占其質量3%?5 %的活性炭，攪拌10?30分鐘后除去其中的活性炭，得到上清液；
5)將所述上清液經離心機分離，得到的固相進行噴霧干燥，得到泛素及類泛素，得到的液相與步驟I)中蛋白乳合并，再次提取。
[0008]所述植物為植物的根、莖、葉、果實或種子，所述植物根莖為木薯、馬鈴薯、甘薯、山藥、芋頭、菊芋、半夏、甘露子、蘿卜、竹筍、油菜、蓮藕、土豆、紅薯或荸薺的根莖;所述植物葉為桑科、藜科、寥科、莧科、十字花科、豆科、旋花科、茄科、菊科、葫蘆科或雨久花科植物的葉子;所述植物種子為杏仁、腰果、榛子、核桃、松子、板栗、白果、開心果、夏威夷果、花生、葵花子、南瓜子、西瓜子、稻米、小麥、玉米或大豆;所述植物果實為葡萄、草莓、香蕉、番石榴、木瓜、蘋果、梨、柑橘、柿子、山楂、桃、梅、杏、龍眼、荔枝、櫻桃、棗或芒果。
[0009]所述植物為植物的根、莖、葉、果實或種子，進一步優選為木薯根莖、馬鈴薯根莖、甘薯根莖、山藥根莖、芋頭根莖、土豆根莖、桑科植物葉子、十字花科植物葉子、豆科植物葉子、茄科植物葉子、核桃仁、花生仁、玉米、大豆、葵花籽、亞麻籽、菜籽、芝麻、杏仁、葡萄、草莓、香蕉、蘋果中的一種或幾種。
[0010]步驟I)中所述蛋白乳中蛋白質含量優選為20?50wt%o
[0011]步驟2)中水浴溫度優選為1I?140 °C。
[0012]步驟2)中水浴溫度大于100°C時，使用高壓容器設備達到所需溫度。
[0013]步驟3)中蒸餾水用量優選為沉淀體積的2倍。
[0014]本發明還涉及一種從動物蛋白乳中提取泛素及類泛素的方法，包含如下步驟:
1)將動物的組織、皮、肉清洗、絞碎后濕磨制漿，經離心機處理，得到上清液為蛋白乳；
2)將所述蛋白乳置于80?140°C水浴中加熱5?10分鐘后過濾，得到粗提液和沉淀；
3)將所述沉淀用蒸餾水清洗后再次過濾，收集濾液；
4)將所述收集的濾液與所述粗提液合并，再加入占其質量3%?5 %的活性炭，攪拌10?30分鐘后除去其中的活性炭，得到上清液；
5)將所述上清液經離心機分離，得到的固相進行噴霧干燥，得到泛素及類泛素，得到的液相與步驟I)中蛋白乳合并，再次提取。
[0015]所述動物優選為節肢動物、環節動物、刺胞動物、可食用魚類、家禽、家畜中的一種或幾種。
[0016]步驟I)中所述蛋白乳中蛋白質含量優選為20?50 wt%0
[0017]步驟2)中水浴溫度優選為101?140 °C。
[0018]步驟2)中水浴溫度大于100 °(:時，使用高壓容器設備達到所需溫度。
[0019]步驟3)中蒸餾水用量優選為沉淀體積的2倍。
[0020]所述動物為環節動物水蛭時，所述類泛素為水蛭素。
[0021]所述高壓容器設備指工作壓力在10?10MPa的容器設備，如高壓鍋，高壓容器罐等。
[0022]本發明的優點是:
I)工藝簡單，提取步驟少，工藝流程短，操作簡單，且操作過程中不引入不安全物質，減少能源消耗，適用于工業化生產； 2)制得的泛素和類泛素可應用在醫藥、保健品等領域，具有極高的價值和廣闊的市場；
3)同時綜合利用動物或植物，副產物可再利用，是一項可持續發展的農業產業化技術。
【具體實施方式】
[0023]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下實施例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
[0024]實施例1
從花生仁蛋白乳中提取泛素及類泛素的方法
1)將花生仁在2wt%的氫氧化鈉水溶液中浸泡2小時后，用清水沖洗干凈，再用0.35?七%的過氧乙酸消毒，然后用清水噴淋沖洗干凈；
2)向步驟I)處理后的花生仁中加入其5倍質量的水，在50°(:左右用砂輪磨漿機熱磨制漿，分離出渣皮去色;再將所得漿液用膠體磨磨至細度為2-4 pm;然后將膠體磨磨后漿液在30 °C左右置入碟式離心機，在轉數6250 r/min條件下離心分離，得到輕相液為植物油脂，重相液為蛋白乳，排渣口得到具有高附加值的渣皮；
3)將得到的脫脂蛋白乳置入磨漿機，進行10次磨漿，得到溶液，利用凱氏定氮法測得總氮為5.05%，換算成蛋白質的含量為20 %;
4)將步驟3)得到的溶液在80°(:恒溫水浴中加熱10分鐘后用普通濾紙過濾，得到粗提液和沉淀；
5)將所得到的沉淀用2倍體積的蒸餾水清洗后再次過濾，收集濾液；
6)將收集的濾液與粗提液合并，加入占其質量3%的活性炭，攪拌25分鐘，再將其置入螺旋卸料離心機，在4500 r/min條件下離心處理，得到除去活性炭的上清液；
7)將所述上清液置入實用新型專利(授權公告號CN203353554 U)公告的分離裝置，
在
55 °C左右、7360 r/min條件下分離出固相和液相，將固相利用離心噴霧干燥機，在進風溫度為120 °(:、壓力為0.3 MPa的條件下，進行噴霧干燥制得泛素及類泛素，將液相與步驟2)中蛋白乳合并，再次提取。
[0025]實施例2
從大豆蛋白乳中提取泛素及類泛素的方法
1)將大豆在3wt%的氫氧化鈉水溶液中浸泡1.5小時后，用清水沖洗干凈，再用0.35?七%的過氧乙酸消毒，然后用清水噴淋沖洗干凈；
2)向步驟I)處理后的大豆中加入其5倍質量的水，在50°C左右用砂輪磨漿機熱磨制漿，分離出渣皮去色;再將所得漿液用膠體磨磨至細度為2-4 Mi;然后將膠體磨磨后漿液在42 °C左右置入碟式離心機，在轉數6110 r/min條件下離心分離，得到輕相液為植物油脂，重相液為蛋白乳，排渣口得到具有高附加值的渣皮；
3)將得到的蛋白乳置入磨漿機，進行10次磨漿，得到溶液，利用凱氏定氮法測得總氮為6.82 %，換算成蛋白質的含量為48 %; 4)將步驟3)得到的溶液在140°C高壓恒溫水浴中加熱5分鐘后用普通濾紙過濾，得到粗提液和沉淀；
5)將所得到的沉淀用2倍體積的蒸餾水清洗后再次過濾，收集濾液；
6)將收集的濾液與粗提液合并，加入占其質量5%的活性炭，攪拌10分鐘，再將其置入振動卸料離心機，在4350 r/min條件下離心處理，得到除去活性炭的上清液；
7)將所述上清液置入實用新型專利(授權公告號CN203353554 U)公告的分離裝置，
在
62°C左右、7530 r/min條件