一種制備卡貝縮宮素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種固液相結合合成多肽的方法，尤其是卡貝縮宮素的制備方法。
【背景技術】
[0002] 預防宮縮乏力產后出血除了按摩子宮外，主要使用收縮子宮的藥物。宮縮劑常用 縮宮素、麥角新堿、前列腺素制劑，各種藥物均有其優點及缺點。縮宮素使用最廣泛，優點是 起效快，安全、副反應小，缺點是作用時間短，半衰期為卜6 min，其作用的發揮依賴于體內 的縮宮素受體，當受體飽和后，無限制加大用量反而效果不佳，并出現副反應，24 h總量應 控制在60 u內。因為以上原因，催產素有時作用有限。麥角新堿對子宮體、子宮下段及子宮 頸均有收縮作用，可引起全子宮強直性收縮，但收縮子宮的同時可使血管平滑肌收縮，可引 起血壓升高，禁用于心血管疾病，國內目前斷貨。常用前列腺素制劑有米索前列醇和卡前列 素氨丁三醇:米索前列醇系前列腺素 E1的衍生物，可引起全子宮有力收縮，但副反應較大， 惡心、嘔吐、腹瀉、寒戰和體溫升高較常見;青光眼、哮喘及過敏體質者禁用。卡前列素氨丁 三醇(商品名：欣母沛）：為前列腺素 F2ct衍生物（15-甲基FGF2a)，也可引起全子宮協調有力 的收縮，作用效果較明顯，單劑量注射后作用持續15~30 min。副反應較米索前醇輕，但價格 較昂貴，目前約600元1支，價格限制了它的廣泛應有，目前主要用于難治性產后出血。
[0003] 卡貝縮宮素是一種合成的具有激動劑性質的長效催產素九肽類似物，它的臨床和 藥理特性與天然產生的催產素類似，引起子宮的節律性收縮，在原有的收縮基礎上，增加其 頻率和增加子宮張力。卡貝縮宮素對非妊娠的子宮沒有作用，僅對妊娠子宮和剛生產的子 宮具有有效的子宮收縮作用。靜脈推注后子宮迅速收縮，可在2 min內達到一個明確強度， 半衰期為40 min，明顯長于縮宮素。本研究顯示，卡貝縮宮素組產后2 h出血量和產后24 h 出血量明顯少于縮宮素組，產后出血率低于縮宮素組，與國內其他研究相符。卡貝縮宮素療 效高于縮宮素的最主要原因是其作用時間長，產后2 h是產婦最容易出血的時間，縮宮素由 于其半衰期短，作用時間也短，而單劑量靜脈注射100 yg卡貝縮宮素對子宮的活性作用可 持續1 h以上，明顯長于普通縮宮素，故作用效果更好。由于其作用時間長，除少數對縮宮素 不敏感者，很少需要再加用其他藥物，有研究表明，在剖官產分娩后降低產后出血發生率方 面，單次靜脈給藥1〇〇 yg至少與連續16 h靜脈滴注催產素的效果相當。
[0004] 在副作用方面，使用卡貝縮宮素少數可見惡心、嘔吐、腹痛、瘙癢、面紅、低血壓、頭 痛、口腔金屬味，但程度很輕，無需處理。本研究每個病例僅使用1支，未見嚴重副反應病例， 重復使用有待進一步研究。目前卡貝縮宮素市場價格約320元，較欣母沛低，患者容易接受。 綜上所述，卡貝縮宮素具有高效、安全、實用的優點，值得臨床推廣。
[0005] 卡貝縮宮素分子結構 1? \J\ I N μ J n -?Η α μ J I|J'J l±l \ ' r
η ΠΑ? μ ZX.^1 η μ=?) /| μ I|J'J |dt| yj J-v ? 式步驟多，要求合成人員經驗豐富，每步驟純化能力強，同時耗時耗力，不利于多肽的大規 模生產。
[0006] 在較為近期的中國專利（公開號CN101555272A)公開了一種卡貝縮宮素的固相制 備方法，較為先進，但是仍有不足：1，收率低，專利公開收率為45%，一般收率可達30%較為正 常;2，純化成本高，液相填充柱本身價格很貴，利用高效液相色譜洗脫也要用大量的乙腈和 水沖洗;造成收率低的根本原因一方面是因為含鹵化合物縮合后切割過程中即與分子內或 者分子間的其他基團反應生成雜質，另一方面是因為在液相色譜柱中由于雜質相近而導致 純化過程中損耗過大。
[0007] 本發明提前將鹵化物和巰基反應，反應完后將鹵代物清洗干凈有效的避免了副反 應，采用高效逆流色譜分離進行無損分離，大大提高收率和操作方便度。
【發明內容】
[0008] 為提高卡貝縮宮素的合成收率，提高合成質量，本發明公開了一種方便快捷，易于 大規模生產的卡貝縮宮素制備方法，主要解決現有制備方法存在的收率低、純化成本高的 技術問題。
[0009] -種制備卡貝縮宮素的方法，包括以下步驟：1)由氨基樹脂通過偶聯劑依次與 Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H、Fmoc-Cys(Alloc)-〇H、Fmoc-Asn(Trt)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fm 〇C-Ile-OH偶聯得到樹脂多肽;2)脫半胱氨酸保護;3)堿性條件下與4-鹵基 丁酸反應，與H-Tyr(0Me)-0tBu偶聯;4)切割多肽，液相關環;5)粗肽經高效逆流色譜純化， 凍干得到卡貝縮宮素。
[0010] 所用氨基樹脂為Rink amide樹脂，替代度為0.4mmol/g~1.2mmol/g。
[0011] 所用偶聯試劑為 DIC/H0Bt、DIC/H0At、PyB0P/H0Bt、TBTU/H0Bt、HBTU/H0BtSHATU/ HOAt中的一種。
[0012]脫除半胱氨酸加保護試劑，為四三苯基膦鈀，苯硅烷和二氯甲烷混合溶劑（四三苯 基膦鈀為樹脂多肽物質的量的3%，苯硅烷:二氯甲烷體積比=1: (10~20))，4_鹵代丁酸為4-溴丁酸或4-氯丁酸。
[0013] 步驟3)具體為，將脫巰基保護劑的樹脂多肽轉移至三口燒瓶中，氮氣保護，加入 DMF溶劑，加入1.5~5倍量(脫巰基保護劑的樹脂多肽物質量為基準)有機堿N-甲基嗎啉，開 啟攪拌，冰浴，滴加1.1~4倍量(脫巰基保護劑的樹脂多肽物質量為基準)4_鹵代丁酸DMF溶 液，反應0.1~2小時，過濾，DMF和甲醇輪換洗滌;與H-Tyr (OMe) -OtBu偶聯，偶聯劑采用前述 偶聯劑。
[0014] 步驟4 )具體為：先由哌啶溶液脫Fmoc保護基，再用TFA溶液將多肽切割保護基脫 除，離心，傾出溶液，粗肽溶于DCM，冰浴加 HOSu，與DCC環合，濾出固體，低溫旋干DCM，正丁醇 溶解多肽，稀碳酸氫鈉溶液洗滌得，卡貝縮宮素粗肽正丁醇溶液。
[0015] 純化方法采用高效逆流色譜，萃取劑為甲醇：正丁醇：水:醋酸體積比=(1~4) : (1~ 6): (1~5): (0.01~1)，根據高效色譜液相質譜確定出峰時間，收集卡貝縮宮素醋酸鹽純肽混 合溶液，乙醚萃取洗掉正丁醇，卡貝縮宮素醋酸鹽純肽水溶液凍干，得卡貝縮宮素產品。
[0016] 高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC )是 20世紀80年代發展起來的一種連續高效的液-液分配色譜分離技術，它不用任何固態 的支撐物或載體。它利用兩相溶劑體系在高速旋轉的螺旋管內建立起一種特殊的單向性 流體動力學平衡，當其中一相作為固定相，另一相作為流動相，在連續洗脫的過程中能保留 大量固定相。由于不需要固體支撐體，物質的分離依據其在兩相中分配系數的不同而實現， 因而避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，不僅使樣品能夠全部回收，回 收的樣品更能反映其本來的特性，特別適合于天然生物活性成分的分離。而且由于被分離 物質與液態固定相之間能夠充分接觸，使得樣品的制備量大大提高，是一種理想的制備分 離手段。
[0017] 本發明的有益效果是:傳統的多肽純化是利用高效液相色譜法，物質在填料中的 洗脫系數分離，在操作需要大量的高純乙腈，操作過程色譜柱的能力也有損耗，是一個昂貴 的耗材，并且化合物會在純化過程中有損耗。本發明采用高效逆流色譜是萃取得原理，沒有 填料，反應產物從進入儀器至產物分離經過數千次萃取過程，并且無化合物殘留于儀器內， 屬于無損純化，本發明優化了萃取溶劑和萃取比例，得到了很好的收率。減少了巰基和鹵素 反應的副產物，雜質減少，純化難度降低，收率達65%，純度99%。
【附圖說明】
[0018] 圖1本發明工藝流程圖。
[0019] 圖2為本發明產品色譜圖。
[0020] 圖3為本發明產品質譜圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面給出實施例以對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只用 于對本發明作進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，本領域的技術人員根 據本
【發明內容】
對本發明作出的一些分本質的改進和調整，仍屬本發明保護范圍； 說明書和權利要求書中所使用的縮寫含義列于下表中：
保護氨基酸為本公司自產；
實施例1: Fm〇C-Gly-氨基樹脂的合成，參照圖1， 將氨基樹脂142克，替代度為0.4mmol/g，加入到固相反應柱中，加入DCM溶脹樹脂30分 鐘后，將 34 克 Fmoc-Gly-OH，43 克 HATU， 17克HOAt溶于自己DMF中冷卻至5°C，通氮氣反應，加入13.7克TMP，室溫反應50分鐘， DMF洗滌3次，DCM和甲醇輪換洗滌3次。
[0022]固相反應器為砂性漏斗，下部連接三通，三通一端接氮氣瓶，三通另一端接抽濾瓶 和真空栗，方便通氮氣和抽濾。
[0023]實施例2:Fm〇c-Gly-氨基樹脂的合成，參照圖1， 將氨基樹脂142克，替代度為1.2mmol/g，加入到固相反應柱中，加入DCM溶脹樹脂30分 鐘后，將 102 克 Fmoc-Gly-OH，129 克 HATU， 51克HOAt溶于自己DMF中冷卻至5°C，通氮氣反應，加入41.1克TMP，室溫反應50分鐘， DMF洗滌3次，DCM和甲醇輪換洗滌3次。
[0024]實施例3，參照圖1，氨基樹脂替代度為0.8mmol/g，偶聯劑DIC/HOBt，其余同實施例 1〇
[0025]實施例4,參照圖1，偶聯劑PyBOP/HOBt，其余同實施例1。
[0026]實施例5，參照圖1，偶聯劑TBTU/HOBt，其余同實施例1。
[0027] 實施例6，參照圖 1，主肽鏈 Fmoc-Ile-Gln(Trt)