一種鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養基及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于哈維弧菌檢測技術領域，具體涉及一種重要貝類一一鮑的病原哈維弧 菌的選擇性顯色培養基及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 膿皰癥是威脅重要貝類品種一一鮑的重要疾病之一，早期已見報道，且已被列入 中國水生動物三類疫病名錄中。該病由弧菌病原引起，通過血淋巴進入鮑的全身組織，以感 染稚鮑為主，夏季易發病，特別是連續高溫時，發病頻繁且持續時間長，常導致皺紋盤鮑和 雜色鮑死亡，死亡率可高達50%~60%，因而給鮑養殖業造成極為嚴重的經濟損失，我們前 期的研究結果確診了膿皰病的病原是哈維弧菌Vibrio harveyi。哈維弧菌也是近年來在海 水貝類養殖過程中出現頻率最高的病原之一。
[0003] 目前，在病原菌的鑒定方面主要有傳統檢測方法、分子生物學方法、免疫學檢測方 法等，而這些方法多數難以進行快速估算病原菌的數量，且難以在短時間內獲得病原菌種 資源并與其它弧菌迅速區分，非常不利于及時地對癥治療。此外，針對水產養殖過程中通過 顯色方法直接診斷海水貝類主要病原菌并快速評估病原菌數量方面，屬空白領域。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養基，該顯色培養基 能對鮑的膿皰癥病原哈維弧菌進行快速區分和鑒定。
[0005] 本發明的目的還在于提供利用上述鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養基進行檢 測和估數的方法，該方法特異性強、靈敏度高、耗時短、成本低。
[0006] 本發明的第一個目的是通過以下技術方案來實現的：一種鮑病原哈維弧菌的選擇 性顯色培養基，每1000mL培養基中含有蛋白胨5~15g、牛肉膏3~5g、蔗糖10~15g、氯化鈉 15~258、卡那霉素0.3~0.58、苯酚紅0.02~0.038，蒸餾水100011^定容，最終?!1為7.8~ 8.2〇
[0007] 優選的，本發明提供的一種鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養基，每1000mL培養 基中含有蛋白胨8~12g、牛肉膏3~4g、蔗糖10~12g、氯化鈉18~22g、卡那霉素0.3~0.4g、 苯酚紅0.022~0.028g，蒸餾水1000mL定容，最終pH為8.0~8.2。
[0008] 最佳的，本發明提供的一種鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養基，每1000mL培養 基中含有蛋白胨l〇.〇g、牛肉膏3.0g、蔗糖10.0g、氯化鈉20.0g、卡那霉素0.4g、苯酚紅 0 · 025g，蒸餾水1000mL定容，最終pH為8 · 2。
[0009] 本發明中的選擇性顯色培養基的營養組成比例和鹽度、pH值等均非常利于鮑病原 哈維弧菌的快速生長，同時利用該病原類群對高濃度卡那霉素的抗性，可完全抑制其它弧 菌種類的生長，可有效將病原哈維弧菌從副溶血弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌等中區分出來， 并可通過顯色時間初步評估哈維弧菌數量級。
[0010] 本發明的第二個目的是通過以下技術方案來實現的:采用上述鮑病原哈維弧菌的 選擇性顯色培養基進行檢測和估數的方法，包括以下步驟：
[0011] (1)制備鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養基:按用量關系，取各原料蛋白胨、牛 肉膏、蔗糖、氯化鈉和苯酚紅，溶于蒸餾水中，調節pH值后，高壓滅菌并冷卻，根據用量關系 加入卡那霉素，定谷后低溫保存待用；
[0012] (2)建立鮑病原哈維弧菌顯色時間表:取上述選擇性顯色培養基，加入鮑病原哈維 弧菌，配制成鮑病原哈維弧菌濃度梯度范圍為1〇 3~1〇8的顯色反應液，封口后搖床培養箱培 養，進行顯色反應，鮑病原哈維弧菌置于上述選擇性顯色培養基中顯示黃色，根據不同濃度 的鮑病原哈維弧菌顯色反應液完全顯色為黃色的顯示時間，建立顯色時間表如下：
[0013]
[0014] (3)鮑病原哈維弧菌的檢測：取鮑組織樣品，置于上述選擇性顯色培養基中，封口 后搖床培養箱培養，進行顯色反應，顯色反應過程中觀察樣品，其中樣品顏色顯示為黃色的 是陽性樣品，樣品顏色顯示為淡紅色的是陰性樣品，記錄陽性樣品完全變為黃色的時間，根 據顯示時間表，確定鮑病原哈維弧菌的數量級。
[0015] 本發明的原理是:鮑病原哈維弧菌在選擇性顯色培養基快速增殖后，代謝產物形 成的酸性環境可使指示劑苯酚紅立即反應從而顯示不同顏色，通過比對顯色時間表，可評 估其中的病原菌數量級，簡易快捷。
[0016] 同時利用哈維弧菌對卡那霉素的抗性，以及細菌對碳源利用能力的不同，利用苯 酚紅的顏色指示變化，可有效將病原哈維弧菌從副溶血弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌中區分出 來，并可通過顯色時間初步評估哈維弧菌數量級。
[0017] 在上述鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養基進行檢測和估數的方法中：
[0018] 步驟（1)中高壓滅菌時溫度優選為115~121°C，時間優選為15~20分鐘。最佳為在 121 °C尚壓滅菌15分鐘。
[0019] 步驟(1)中冷卻優選至15~20°C。
[0020] 步驟(2)~(3)中搖床培養箱培養時溫度優選為30~35 °C恒溫培養，最佳為30 °C。 [0021] 步驟(2)~(3)中顯色反應時間優選為0.5~16小時。
[0022]步驟(3)中所述的鮑組織樣品優選為鮑的內臟或足部肌肉組織。
[0023]步驟(3)中所述鮑組織樣品與選擇性顯色培養基的用量關系優選為0.3~0.5g:7 ~8mL〇
[0024]本發明具有如下優點：
[0025] (1)本發明的鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養基以苯酚紅作為顯色劑，同時添 加了定量的卡那霉素，大大提高了檢測準確性，陽性結果顯色明顯，觀察方便，且可通過顯 色時間長短可對病原哈維弧菌數量進行評估預測；
[0026] (2)本發明利用哈維弧菌對卡那霉素的抗性，以及細菌對碳源利用能力的不同，利 用苯酚紅的顏色指示變化，可有效將病原哈維弧菌從副溶血弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌中區 分出來，并可通過顯色時間初步評估哈維弧菌數量級；
[0027] (3)本發明以選擇性顯色培養基代替傳統繁瑣的分離鑒定方法，通過顯色反應可 以直接對重要貝類品種一一鮑的膿皰癥病原哈維弧菌進行鑒定，方便快捷；
[0028] (4)本發明液體顯色培養基制作工藝簡單，能有效的檢測培養貝類病原哈維弧菌， 特異性強、靈敏度高、耗時短，成本低，可用于鮑等重要貝類常見病原哈維弧菌的快速檢測 和數量預測，減少疾病造成的經濟損失；
[0029] (5)本發明鑒定和評估數量的步驟簡單，從取樣到獲得結果只需數小時即可完成， 大大簡化了操作步驟，也不需要使用復雜的檢測儀器，從而節省了時間，鑒定和定量的成本 低，有利于在基層檢測部門推廣應用，很大程度提高了工作效率。
【附圖說明】
[0030] 圖1是本發明實施例6中創傷弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維弧菌的顯色結果， 其中1是創傷弧菌，2是副溶血弧菌，3是溶藻弧菌，4是哈維弧菌，其中1~3顯示結果為淡紅 色，為陰性，4哈維弧菌顯示為黃色，為陽性，淡紅色為陰性反應，黃色為陽性反應；
[0031] 圖2是本發明實施例7中患病個體內臟組織樣品和健康個體的內臟樣品顯色結果， 其中1是空白對照（陰性，淡紅色），2是健康個體內臟組織樣品（陰性，淡紅色），3是患病個體 的內臟組織樣品（陽性，黃色）；
[0032]圖3是本發明實施例8中患病個體足部組織樣品和健康個體的組織樣品顯色結果， 其中1是空白對照（陰性，淡紅色）；2是健康個體的足部肌肉組織（陰性，淡紅色）；3是患病個 體的足部肌肉組織樣品（陽性，黃色）。
【具體實施方式】
[0033] 實施例1
[0034]鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養基配方為:每1000mL培養基中含有蛋白胨10g、 牛肉膏3g、鹿糖10g、氯化鈉20g、卡那霉素0.4g、苯酸紅0.025g，蒸餾水1000mL定容，最終pH 為 8·2〇
[0035] 其制備方法為：按用量關系，取各原料蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、氯化鈉和苯酚紅，溶 于蒸餾水中，調節pH值為8.2后，高壓滅菌并冷卻，根據用量關系加入卡那霉素，定容至 1000mL，低溫保存待用。
[0036] 高壓滅菌時溫度為115~121°C，時間為15~20分鐘;冷卻至15~20°C。
[0037] 建立鮑病原哈維弧菌顯色時間表:取上述選擇性顯色培養基，加入鮑病原哈維弧 菌，配制成鮑病原哈維弧菌濃度梯度范圍為10 3、104、105、106、107和10 8的顯色反應液，封口 后搖床培養箱培養，進行顯色反應，鮑病原哈維弧菌置于上述選擇性顯色培養基中顯示黃 色，根據不同濃度的鮑病原哈維弧菌顯色反應液完全顯色為黃色的顯示時間，建立顯色時 間表如下：
[0038]
[0039] 鮑病原哈維弧菌的檢測：取鮑樣品組織，置于上