黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于魚類免疫學技術領域，具體涉及黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體的制備 方法及應用。
【背景技術】
[0002] 黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)是我國常見的一種重要的小型經濟魚類，因 其肉質鮮嫩、少細刺，深受消費者喜愛。我國黃顙魚大規模養殖已有10余年歷史，主要集中 在兩湖及長三角地區。隨著其養殖規模的迅速擴大，養殖密度的不斷提高，疾病問題日益凸 顯，其中以細菌性疾病為主。在保護水環境和食品安全的高要求之下，免疫預防成為疾病防 治的最佳手段，疫苗是其典型代表。現階段缺乏有效的黃顙魚免疫效果評價體系，而利用黃 顙魚免疫球蛋白單克隆抗體對免疫后抗體水平變化規律進行分析，可以準確的評價疫苗效 果，因此，對黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體的研究在疫苗的開發應用中具有重要意義。目前 未見關于黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體的報道。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種雜交瘤細胞株，并由該雜交瘤細胞株所產生的黃顙魚免 疫球蛋白的單克隆抗體。
[0004] 本發明的另一個目的是提供一種黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體的制備方法。
[0005] 本發明的再一目的提供一種黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體的用途及其用法。
[0006] 為實現目的之一，本發明采用的技術方案是:一種黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體， 所述的單克隆抗體是由名稱為：雜交瘤細胞株F6-F2,保藏單位為：中國典型培養物保藏中 心，保藏單位地址為：中國武漢省武漢大學;保藏號為:CCTCC NO: C2015152，保藏日期為： 2015年9月13日的雜交瘤細胞株產生。
[0007] 為實現目的之二，本發明采用的技術方案是:一種所述的黃顙魚免疫球蛋白單克 隆抗體制備方法，包括如下步驟:將黃顙魚血清經鹽析法和親和柱層析法純化得到黃顙魚 免疫球蛋白；以純化的黃顙魚免疫球蛋白免疫BALB/c小鼠；融合免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤 細胞;經免疫學方法檢測，篩選出分泌黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞F6-F2; 其所分泌的抗體即為黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體。
[0008] 所述的鹽析法和親和柱層析法是將黃顙魚血清經飽和硫酸銨（SAS)分級鹽析沉 淀后獲得粗提液，再將粗提液透析后過Protein A親和層析柱進行純化。
[0009] 所述的免疫學方法是間接酶聯免疫吸附法。
[0010] 為實現目的之三，本發明采用的技術方案是:一種所述的黃顙魚免疫球蛋白單克 隆抗體用于對黃顙魚疫苗免疫效果進行檢測評價，所采用的方法是:利用所述黃顙魚免疫 球蛋白單克隆抗體建立三抗體夾心酶聯免疫吸附法(TAS-ELISA)。
[0011] 本發明優點在于:制備了黃顙魚免疫球蛋白的單克隆抗體及分泌該抗體的雜交瘤 細胞株，建立了三抗體夾心酶聯免疫吸附法，能夠對多種疫苗免疫效果進行評價，為疫苗的 開發應用奠定基礎。
【附圖說明】
[0012] 圖1為實施例1所提供的黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體的檢測黃顙魚鲇魚愛德華 氏菌強毒株滅活疫苗和弱毒株活疫苗不同方式免疫的血清特異性抗體水平的結果。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1: 一、黃顙魚免疫球蛋白的提取 黃顙魚血清的采集： (D健康黃顙魚尾靜脈采血，室溫靜置lh，4°C過夜，次日4000r/ min離心15min，取上清 液，-80 °C保存備用。
[0014] 黃顙魚免疫球蛋白的分離、純化： ?'?Η包和硫酸銨（SAS)鹽析法:黃顙魚血清加等體積生理鹽水稀釋后，緩慢加入pH7.0 的飽和硫酸銨至30%飽和度，4°C靜置過夜，10000r/min離心30min，取上清繼續加入飽和硫 酸銨至最終飽和度為50%，同上處理，收集沉淀，沉淀溶解于0.02mol/L PBS(PH7.4)，再經 PBS 4°C透析脫鹽，獲得黃顙魚免疫球蛋白粗提液，-80 °C保存備用。
[0015] ③Protein A親和層析柱純化：取黃顙魚免疫球蛋白粗提液l.OmL，與HiTrap Protein A HP柱4°C結合3-4h;用(h02mol/L ρΗ7·4 PBS以 1.0-1.5mL/min流速洗脫未結合 蛋白至0D28q〈0.01;用0. lmol/L pH3.0檸檬酸以1.0-1.5mL/min流速洗脫洗脫結合蛋白，以 200μL7管收集洗脫峰，合并洗脫峰，用0.02mol/L pH7.4 roS 4°C透析過夜，_20°C保存備 用;該純化蛋白的重鏈分子量為73KD，輕鏈分子量為30KD。
[0016] 二、黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體的制備 (l)BALB/c鼠的免疫 tl基礎免疫:取純化的黃顙魚血清免疫球蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分乳化作為 抗原，免疫劑量為〇. 2ml/尾，背部皮下多點及腹腔注射6周齡BALB/c小鼠。
[0017] 加強免疫:基礎免疫2周后，取純化的黃顙魚血清免疫球蛋白與等體積弗氏不 完全佐劑充分乳化作為抗原，加強免疫小鼠，免疫劑量與方法同上。
[0018] 這;二次加強免疫:加強免疫間隔2周后再次加強免疫，免疫劑量與方法同上。
[0019] ?融合前三天加強免疫：融合前3d，取純化的黃顙魚免疫球蛋白作為抗原，背部 皮下多點及腹腔注射小鼠，免疫劑量為〇. lml/尾。
[0020] (2)細胞融合 il飼養細胞的制備:脫頸處死正常BALB/c小鼠，無菌條件下打開腹部皮膚，用無菌注 射器取PRMI-1640培養基注射到小鼠腹部內，反復抽吸后，將液體全部吸出，移入96孔細胞 培養板內，置于37°C、5 %C02培養箱中培養待用。
[0021] 義I脫頸處死免疫小鼠，無菌條件下取免疫小鼠的脾細胞過100目篩網，與SP2/0 骨髓瘤細胞混合于融合管內，lOOOrpm離心10min，棄去上清;輕彈融合管底，融合管放入37 °C水浴中，吸取lmL預熱至37°C的PEG4000于lmin中內加完，靜置90s;繼續緩慢加入15mL預 熱至37°C的PRMI-1640培養基，使PEG失效，再補加25mL的PRMI-1640培養基，lOOOrpm離心 lOmin，棄去上清;沉淀細胞用預熱的含1%HAT的PRMI-1640培養基重懸，加入裝有飼養細胞 的96孔板，置37 °C、5 %C02培養箱培養。
[0022] i|)培養5-7天后進行換液處理，吸出100μL7孔培養液，加入等量含HAT的培養基。
[0023] (3)陽性雜交瘤的篩選和克隆 ?篩選:待融合細胞生長到培養孔面積的1/10時，取培養上清用間接ELISA法進行篩 選，用純化的黃顙魚血清免疫球蛋白作為包被抗原，2yg/mL，lOOyL/孔，4 °C過夜包被；10%小 牛血清于37°C封閉3h，用PBST洗滌3次，5min/次;加入雜交瘤上清37°C孵育lh，以SP2/0上清 作為陰性對照，陽性對照為免疫血清；同上洗滌3次，加入1:1000辣根過氧化物酶標記的羊 抗鼠 IgG37°C孵育lh，100yL/孔；同上洗滌3次孔加入TMB顯色液，100μL7孔，于暗處反應 30min，加入2 mol/L硫酸溶液終止反應，50yL/孔，450nm下讀取0D值(Ρ/Ν 2 2.1時判為陽 性)。
[0024] ?克隆：采用有限稀釋法進行克隆，提前制備飼養細胞(方法同上），將篩選的陽 性雜交瘤細胞用血球計數板進行活細胞計數，用PRMI-1640培養基進行10倍梯度稀釋，設3 個濃度，將上述濃度細胞懸液分別加入含飼養細胞的96孔培養板內，100μL孔，平均每孔含 1個雜交瘤細胞，置37°C、5 %C02培養箱培養。培養期間用間接ELISA法檢測各孔培養上清， 用經復測仍為強陽性的克隆用有限稀釋法再次克隆，克隆化至陽性率達100%，即可定株。本 發明獲得了外觀飽滿，分裂旺盛的雜交瘤細胞，其名稱為:雜交瘤F6-F2,保藏單位為：中國 典型培養物保藏中心，保藏號為:CCTCC N0:C2015152,保藏日期為:2015年9月13日。
[0025] (I;凍存：取生長旺盛、形態良好的雜交瘤細胞株，制備細胞懸液，lOOOrpm離心 lOmin，棄去上清，加入含10%DMS0的PRMI-1640培養基使細胞終濃度為106個/mL，然后轉移 到凍存管中。經4°C 1 Omin，-20 °C 30min，-80 °C過夜后，浸入液氮中長期保存。
[0026] (4)腹水制備 ：Ι.?選取8-10周齡的BALB/c小鼠，提前7-10d注射滅菌的液體石蠟0.5ml/尾。
[0027] (?取對數生長期的雜交瘤細胞，lOOOrpm離心10min，棄上清，用無菌生理鹽水離 心洗滌1次，細胞計數后稀釋至5 X 106,腹腔注射小鼠。
[0028] 識}:腹腔注射雜交瘤細胞7-14d后，選取腹部明顯隆起小鼠，用12或16號針頭插入 腹下部采集腹水2-5