一種抗腫瘤干細胞抗原oct4特異性ctl及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生命科學技術領域，尤其涉及一種抗腫瘤干細胞抗原0CT4特異性CTL 及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 在我國，惡性腫瘤已成為危害人類健康的重要疾患之一，每年發病率為235.23/10 萬人，死亡率為148.81/10萬。近年來隨著科技，醫學診斷和治療水平的發展和提高，但腫瘤 的總體死亡率和生存率仍無明顯改善，復發和轉移依然是導致癌癥預后不佳的主要原因。 隨著對腫瘤生物學特性的深入研究，目前認為一些惡性實體腫瘤(腦膠質瘤、肺癌、乳腺癌 和大腸癌等)是一種干細胞疾病，即腫瘤來源于腫瘤干細胞，腫瘤干細胞又稱為腫瘤起始細 胞。這類細胞僅占整個腫瘤細胞一小部分，但是具有自我更新能力和多向分化潛能，是形成 不同分化程度的腫瘤和腫瘤不斷生長的根源，可能是腫瘤治療失敗的根源。進一步研究發 現，腫瘤干細胞不僅較其他腫瘤細胞更具轉移潛能，而且對化療、放射更具抗性。因此，如何 殺滅整個腫瘤內的干細胞以獲得腫瘤穩定而長久的退縮，甚至治愈是目前腫瘤學領域研究 的熱點和重點。近期有多項研究報道0ct4在多種惡性腫瘤組織或細胞系中異常表達，提示 0ct4除了活躍于干細胞的生長過程，還極有可能參與成體細胞及腫瘤的發生過程，這為 0ct4與惡性腫瘤的相關性研究提供了思路和方向。
[0003] 0ct4是Pit-Oct-Unc(POU)轉錄因子家族的成員之一，由P0U5F1基因編碼產生的， 定位于6號染色體上(6p21.31)，長度為16.40kb，屬于§:類蛋白。〇ct4基因就是其中一個關鍵 基因，也被稱為0(^3101]5?1、(^^3或〇^4，是?01]轉錄因子家族中的一員。0(^4能維持胚胎 干細胞的未分化狀態并促進其不斷增殖，而它在腫瘤的發生、增殖及分化過程中起著一定 作用。研究發現，〇ct-4的異常高表達可增加干細胞轉變為惡性腫瘤細胞潛能，而抑制其表 達則可以抑制惡性腫瘤的發生、發展，并且〇ct-4表達水平的高低和生殖系統腫瘤的惡性程 度有顯著的正相關性。0CT4僅在腫瘤干細胞中存在，而腫瘤干細胞是存在的極少量的具有 自我更新、高致瘤力、侵襲力及耐藥性的原始未分化細胞。對維持腫瘤干細胞自我更新、致 瘤力、侵襲力及耐藥性等特性有重要作用，靶向0CT4的治療將為消滅肺癌干細胞提供新思 路。針對腫瘤干細胞的新型療法將與現有手術、化療、放療等傳統方法相結合，給癌癥患者 帶來新的希望和福音。因此，以0CT4為靶點的針對腫瘤干細胞的靶向治療將具有重要的臨 床意義。一方面，可能作為臨床上提供判斷腫瘤預后的分子指標；另一方面，可以利用其作 為分子靶基因進行抗腫瘤治療，來克服腫瘤放化療的抵抗性，提高腫瘤的治療療效。
[0004] 在人類抗癌歷史上，與癌癥抗爭有過三大利器：外科手術，化療，與放射治療。至 此，免疫科學家斯坦曼利用先前發現的樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)，激發自身的免疫 力清除腫瘤，利用自己的研究成果，將生命由預期的數月延長到四年。由于他對免疫領域的 貢獻在2011年獲得諾貝爾生理醫學獎，在腫瘤領域并開創了一個新的天地一一腫瘤免疫細 胞治療。他的研究成果現在已經廣泛應用于臨床，已經成為繼手術、放、化療后的第四種癌 癥治療方式。由于腫瘤免疫細胞治療能夠聯合手術、化療、放療精準清除殘余腫瘤細胞，防 止復發和轉移，加強免疫監視作用，提升患者生存質量和時間，并且沒有放化療的毒副作用 和手術的巨大傷害。近年來，在臨床應用中受到越來越廣泛的關注，是國內外研究的熱點， 已被公認為是最具前景的腫瘤治療方法。
[0005] 過繼性免疫細胞治療是指通過輸入自身或同種異體的腫瘤殺傷細胞來治療腫瘤 的方法。它不僅可以糾正細胞免疫功能的低下，促進宿主抗腫瘤免疫的功能，還可以直接發 揮抗腫瘤的作用。其中細胞毒性T細胞的過繼治療有著特殊的優越性。細胞毒性T細胞的過 繼治療是實體腫瘤，尤其是腫瘤相關抗原比較明確的惡性黑色素瘤、結直腸癌、肝癌、前列 腺癌、肺癌等的研究熱點。特異性CTLs(細胞毒性T細胞)的產生是通過將腫瘤抗原負載成熟 的DC(樹突狀細胞)刺激T細胞從而獲得抗原的特異性CTL克隆。這種CTL能識別并殺傷攜帶 相應腫瘤抗原的惡性細胞，經過大量的擴增就能應用于臨床治療。這種治療方法相比其他 的治療方法具有易獲得、可操作性強，靶向性好，安全性高等特點。
[0006] 但是，過繼性T細胞轉移還面臨很多的問題:DC的成熟程度低，免疫耐受，特異性活 化T細胞的數量不足等等。由于DC擴增具有很大的難度，所以這也間接限制了特異性活化T 細胞的數量。以樹突狀細胞疫苗為代表的腫瘤免疫治療成為繼手術、化療、和放療后的第四 種抗腫瘤療法，主要利用腫瘤細胞的抗原物質刺激機體產生特異性腫瘤細胞免疫殺傷，從 而達到消滅腫瘤的目的。與傳統的抗腫瘤治療相比，DC疫苗介導的免疫治療具有安全性好、 特異性高等諸多優點，目前已被廣泛用于治療肺癌、結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等 各類惡性腫瘤，然而其臨床療效仍有待進一步提高。樹突狀細胞(DC)作為體內功能最強的 抗原遞呈細胞，是激發機體產生抗腫瘤免疫應答的首要核心環節。它能攝取抗原，并將抗原 信息通過MHC-I類分子提呈給CD8+T淋巴細胞，能夠誘導特異性的細胞毒性T淋巴細胞 (cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成，繼而殺死腫瘤細胞，適用于多種腫瘤的免疫療法。因 此，提高DC對抗原的攝取量和提呈能力是增強其臨床療效的重要策略。
[0007]納米級脂質體是由磷脂雙層殼包裹水相核心形成的球形的實體，其結構類似生物 膜，是一種生物相容性好且無毒的納米材料。它可包封水溶性和脂溶性藥物，具有減少藥物 劑量、緩釋、及靶向性釋放藥物等優點，因而被廣泛用于納米級抗腫瘤藥物的開發。此外，納 米級脂質體也是一種優良的抗原載體，不僅能夠包裹一系列理化性質不同的抗原及免疫佐 劑，保護蛋白多肽抗原不被降解，還可以促進抗原呈遞細胞對抗原的吞噬及呈遞，提高機體 的特異性免疫反應。基于以上這些優點，納米級脂質體作為一種新型的疫苗載體，正逐漸用 于細菌疫苗、病毒疫苗、抗寄生蟲疫苗以及抗腫瘤疫苗等研制開發。中性脂質體和表面攜帶 正電荷的陽離子納米級脂質體是最常用的納米疫苗載體。其中特別值得關注的是陽離子納 米級脂質體，它不但是優良的蛋白/多肽抗原載體，還是一種新型的免疫佐劑，可直接活化 抗原呈遞細胞，增強疫苗誘導的免疫反應。
[0008]目前腫瘤的細胞免疫治療效果仍不理想，主要原因包括如下兩方面：1)腫瘤患存 在免疫抑制的微環境，一方面，腫瘤組織的T淋巴細胞產生免疫耐受，另一方面，腫瘤細胞能 夠分泌多種免疫抑制因子，誘導產生調節性T淋巴細胞或抑制DCs功能。2)腫瘤免疫治療中 應用的抗原大多表達在已分化的腫瘤細胞上，而腫瘤干細胞并不表達這些抗原，所誘發的 免疫殺傷反應并不針對腫瘤干細胞。加上目前常規DC加入患者腫瘤細胞裂解得到的腫瘤抗 原，使DC負載腫瘤抗原，雖然這種方法能使得DC攝取到患者的腫瘤抗原，但由于腫瘤抗原的 抗原性較弱，DC對腫瘤抗原攝取量較少，其遞呈抗原能力也就較低，使其產生的CTL細胞的 殺傷活性不足，并且利用單純的細胞因子放大擴增CTL細胞數量有限，產生的Tcm比例小，進 而影響抗腫瘤治療效果。
【發明內容】
[0009] 本發明針對現有的腫瘤免疫細胞抗腫瘤療效不佳等問題，提出采用靶向樹突狀細 胞上c-型凝集素受體的陽離子脂質體作為抗原載體，包裹腫瘤干細胞抗原0ct4，通過大大 提高DC細胞對腫瘤抗原的攝取效率和抗原呈遞能力，增強其抗腫瘤作用，結合工程細胞和 細胞因子大量擴增抗原特異性T細胞和Tcm，從而增強抗腫瘤免疫作用。此外，本發明以腫瘤 干細胞抗原0CT4制備的抗原特異性CTL創新之處在于：以腫瘤干細胞為治療的靶目標，能夠 誘導更有效的靶向殺傷腫瘤干細胞的特異性細胞毒性T淋巴細胞，直接針對腫瘤發生和復 發的根源，使腫瘤治療更具有"治本"性。
[0010] 為了實現上述目的，本發明所采取的技術措施為：
[0011] -種抗腫瘤干細胞抗原0CT4特異性CTL的制備方法，包括以下步驟：
[0012]步驟一，制備包裹有腫瘤干細胞抗原0CT4的靶向樹突狀細胞C-型凝集素受體的陽 離子脂質體載體；
[0013] 步驟二，利用所述步驟一得到的陽離子脂質體載體將腫瘤干細胞抗原0CT4負載于 成熟DC細胞；
[0014] 步驟三，利用所述步驟二得到的成熟DC細胞誘導得到0CT4特異性T淋巴細胞和中 樞性記憶性T淋巴細胞。
[0015] 為了進一步優化上述技術方案，本發明所采取的技術措施還包括：
[0016] 進一步地，所述步驟一中具體包括以下步驟：
[0017] 步驟1，提供聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂，將c-型凝集素類型的糖連接在聚乙二醇 衍生化乙醇胺磷脂，得到C-型凝集素類型的糖修飾的聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂；
[0018] 步驟2,將陽離子脂和步驟1中得到的C-型凝集素類型的糖修飾的聚乙二醇衍生化 乙醇胺磷脂分別溶解于氯仿和甲醇的混合溶劑中，得到混合液；
[0019] 步驟3,用旋轉蒸發儀將步驟2中得到的混合液旋轉蒸干，使之形成一層均勻的薄 膜，真空干燥后加