生物反應器及其攪拌槳和使用其培養til細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞培養領域，尤其涉及一種生物反應器及其攪拌槳和使用其培養 TIL細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL細胞)是一群存在于腫 瘤間質中的異質性淋巴細胞，TIL細胞對癌性胸、腹腔積液患者療效顯著。一般從腫瘤組織、 腫瘤引流淋巴結、癌性胸腹水中分離出的淋巴細胞經IL-2培養得到，其腫瘤殺傷活性為MHC 限制性，即為自體腫瘤特異性殺傷細胞，具有⑶3+⑶8+或⑶3+⑶4+表面標志。
[0003] 經測試TIL細胞的抗腫瘤效果是LAK的50~100倍，TIL細胞回輸到體內血液及腫瘤 中可以存留達兩個月之久，因此它有著巨大的潛在臨床治療價值。目前，TIL細胞治療被廣 泛應用于臨床治療，并取得良好效果。很多實驗室開展的TIL細胞培養大多數為小規模培 養，把從癌性胸腹水離心得到的細胞用密度梯度離心法分離得到TIL細胞，用含10%FBS的 RPMI 1640培養基和IL-2接種到培養瓶中，通過添加 IL-2促進TIL細胞在體外大量擴增，中 分裝到培養瓶中或者培養袋中擴增培養。
[0004] 現有TIL細胞的培養規模小，操作復雜，步驟繁瑣，擴增倍數低，所擴增得到的數量 不夠用于臨床治療，而且培養密度不能過高，浪費培養基，不利于節約成本和培養空間。此 外表面抗原表達量低，殺傷效果差。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種生物反應器及其攪拌槳和使用其培 養TIL細胞的方法。
[0006] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0007] -種使用生物反應器培養TIL細胞的方法，攪拌槳外包裹有減小剪切力的材料。
[0008] 優選地，所述使用生物反應器培養TIL細胞的方法，包括以下步驟：
[0009] 用X-VIV0 15培養基將PBMC按照1 X 106cells/ml的密度接種于培養瓶中，添加1% 培養基體積的TNF-α溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液，在37°C、5 %⑶2條件下培養，每2~3天 補充適量的培養基和IL-2，當培養體系達到一定體積后，轉入生物反應器中繼續培養至兩 周；
[0010] 所述TNF-a溶液的濃度為50~500ng/ml，IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml，0KT-3 溶液的濃度為500~2000U/ml。
[0011] 優選地，所述TNF-a溶液的濃度為200ng/ml，IL-2溶液的濃度為300U/ml，0KT-3溶 液的濃度為500U/ml。
[0012]優選地，當培養體系大于500ml時，轉入2L生物反應器中繼續培養。
[0013]優選地，在生物反應器中培養TIL細胞的條件為：溶氧量為50%，pH7.2,攪拌速度 為45rpm〇
[0014] 優選地，所述PBMC通過以下方法獲得：
[0015]外周血和生理鹽水按體積比1:1進行稀釋得到血液稀釋液，將其加至二分之一倍 體積的淋巴細胞分離液上方，升降速調為0,800g離心30min，取單個核細胞層，用RPMI1640 培養基清洗兩次，用X-VIV0-15培養基重懸細胞即得PBMC。
[0016] -種生物反應器攪拌槳，所述攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。
[0017] -種生物反應器，所述生物反應器的攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。
[0018] 優選地，所述減小剪切力的材料為醫用硅膠管或食用橡膠管。
[0019] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0020] 1、本發明使用生物反應器培養TIL細胞，在攪拌槳外包裹可以減小剪切力的材料， 可以降低細胞受到的剪切力傷害，有利于細胞大量擴增。
[0021 ] 2、本發明使用生物反應器培養TIL細胞，在培養過程中不停的攪拌，為動態系統， 有利于細胞進行氣體交換和為細胞提供均一的培養環境，有利于細胞大量擴增。
[0022] 3、本發明使用生物反應器培養TIL細胞，在保證細胞質量的前提下，能夠顯著提高 細胞培養密度，有利于節約培養基和培養空間。
[0023] 4、本發明使用生物反應器培養TIL細胞，更接近人體內三維生長環境，與使用培養 瓶、培養袋等細胞貼壁生長的培養方式相比，更利于細胞大量擴增，可以大規模培養TIL細 胞，而且所得TIL細胞表面抗原表達量較高，對腫瘤細胞的殺傷活性較強。
【附圖說明】
[0024]圖1為各實施例和對比例培養的TIL細胞對HepG2細胞的殺傷活性結果。
【具體實施方式】
[0025]為了更好的說明本發明，下面結合附圖和具體實施例做進一步說明。本發明中所 用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領域所熟知的，在此不再贅述。 [0026] TIL細胞是PBMC在體外用多種細胞因子共同培養一段時間后獲得的一群異質細 胞。PBMC可以使用現有任何方法獲得。本發明中PBMC通過以下方法制備：
[0027]把60ml外周血轉移至離心管中，用生理鹽水按體積比1:1進行稀釋，得到血液稀釋 液;在一新離心管中加入淋巴細胞分離液，把血液稀釋液緩慢添加至淋巴細胞液層上方，形 成明顯的分界線，其中，淋巴細胞分離液與血液稀釋液的體積比為1:2;升降速調為0,800g 離心30min，離心結束后，用巴氏吸管小心抽取單個核細胞層至另一新離心管中，往該離心 管中添加 RPMI1640培養基清洗細胞，300g離心5min，棄上清，再次添加 RPMI1640培養基清洗 細胞，300g離心5min，棄上清；用X-VIV0-15培養基重懸細胞得到PBMC懸液。取20μ1 PBMC懸 液用臺盼藍染色法(臺盼藍與PBMC懸液體積比為1:1)進行計數。
[0028] 實施例1
[0029]自2L生物反應器(購自北京元唐盛興科技有限公司，美國BELLC0)中取出攪拌槳， 在攪拌槳外套上醫用硅膠管，紫外照射滅菌后，重新將攪拌槳裝回生物反應器內。使用該生 物反應器培養TIL的方法如下：
[0030] 取2 X 107個PBMC，按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培養基接種于T75培養 瓶中，添加 TNF-α溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液培養，TNF-α溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液 的添加量為培養基體積的1 %。根據細胞的擴增情況，進行分瓶培養，當培養體系總量大于 500ml時，將其轉入2L生物反應器中，按照溫度37 °C，C02通氣量為5 %，溶氧量為50 %，pH為 7.2，攪拌速度為45印111的條件繼續培養至兩周，培養基為含1~101]/111111^-2、0.5~5即/1111 TNF-α 和5 ~20U/ml0KT-3 的X-VIVO 15 培養基。
[0031] 所述TNF-a溶液的濃度為50~500ng/ml，IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml，0KT-3 溶液的濃度為500~2000U/ml。本實施例中所述TNF-a溶液的濃度為200ng/ml，IL-2溶液的 濃度為300U/ml，0KT-3溶液的濃度為500U/ml。
[0032] 整個培養過程中觀察并記錄細胞生長情況，每2~3天進行細胞計數并補充適量的 培養基、TNF-a、IL-2和0KT-3，使細胞密度為1 X 106ce 11 s/ml，培養體系中IL-2的濃度為1~ 10U/ml，TNF-a 的濃度為0.5~5ng/ml