一種經腺病毒基因修飾的腫瘤特異性細胞毒性t淋巴細胞的培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種淋巴細胞的培養方法,特別涉及一種經腺病毒基因修飾的腫瘤特 異性細胞毒性Τ淋巴細胞的培養方法。 (二)
【背景技術】
[0002] 免疫細胞治療是治療癌癥的新的一種治療手段,2008年,美國貝勒醫學院提出DC 疫苗組合專利申請:沉默免疫負調控基因技術(inhibition of Antigen Presentation Attenuators,iAPA)俗稱"癌怕"技術,就是利用小干擾核糖核酸(siRNA)特異性阻斷DC細胞 中關鍵的負調節因子S0CS1基因,使其基因表達沉默,誘導機體突破自身對腫瘤的免疫耐 受,增強抗原特異性免疫反應,進而提高腫瘤免疫治療的臨床療效。與傳統的DC-CIK細胞相 比,iAPA技術能夠阻止DC細胞進入免疫耐受狀態,促進CTL特異性免疫活性的獲得。而且, iAPA腺病毒載體中含有癌細胞高效表達的腫瘤抗原基因 Survivin和MUC1,Survivin是凋亡 抑制蛋白家族成員,具有腫瘤特異性,只表達于腫瘤和胚胎組織,且與腫瘤細胞的分化增殖 及浸潤轉移密切相關;MUC1在多種腫瘤中異常表達,主要表現為:①表達量增高,可達正常 時的100倍以上;②細胞表面分布的改變,極性分布喪失,整個細胞表面均表達;③結構改 變,主要由于糖基化不全,出現新的糖鏈及肽表位。主要組織相容性復合體MHC將腫瘤抗原 蛋白呈遞在DC表面,激活腫瘤抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞,增強CTL抗癌靶向性;鞭毛 蛋白基因可以可操作地連接至信號前導序列,用于分泌,并隨后以自分泌和旁分泌的方式 結合到DCs上的表面TLR5(Toll-like rec印tor 5),激活DC細胞病原菌識別能力。
[0003] 沉默免疫負調控基因(iAPA)技術是一種新型的腫瘤免疫細胞治療技術。研究發 現,經沉默免疫負調控技術處理的樹突狀細胞聯同細胞毒性T淋巴細胞(iAPA-DC/CTL)經瘤 體局部和靜脈注射后,可有效抑制人肝癌細胞系HepG2細胞小鼠皮下移植瘤的生長。瘤體局 部注射的iAPA-DC可有效呈遞腫瘤抗原,并趨向引導經尾靜脈注射的CTL向瘤體組織的迀 移,產生殺滅腫瘤細胞,抑制腫瘤的生長與迀移的作用。
[0004] 統觀現有技術不難發現,現有技術存在很多不足之處:現有免疫細胞治療中應用 的免疫細胞主要包括^、疆、1^、0(:-(:11(,是免疫細胞的一類,但是其抗原特異性低,對腫 瘤細胞的靶向性低;iAPA-DC/CTL技術具有一定的抗原特異性,但是CTL單純在體外增殖,不 具有腫瘤抗原特異性;而且,受血液成分單采機的限制,不是每個醫院都能夠實現單個核細 胞的采集,產生局限性;腫瘤病人自體免疫較弱,一次性抽取大量免疫細胞可能會對患者造 成更壞的影響。 (三)
【發明內容】
[0005] 本發明為了彌補現有技術的不足,提供了一種步驟簡單、操作穩定、對患者無傷害 的經腺病毒基因修飾的腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞的培養方法。
[0006] 本發明是通過如下技術方案實現的:
[0007] 一種經腺病毒基因修飾的腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞的培養方法,以癌癥患 者的臍血或自體外周血為處理對象,包括如下步驟:
[0008] (1)從臍血或自體外周血中分離出單個核細胞,重懸于X-VIV015培養基中靜置培 養;
[0009] (2)將培養單個核細胞的培養瓶晃動,分離貼壁細胞和未貼壁細胞,將貼壁細胞誘 導為未成熟DC細胞;
[0010] (3)將未成熟DC細胞通過iAPA腺病毒因子轉染并誘導為成熟DC細胞;
[0011] (4)將成熟DC細胞和T細胞混合共培養,連續刺激得到CTL細胞;
[0012] (5)將經DC細胞激活的CTL細胞進行增殖培養。
[0013] 本發明在現有細胞治療細胞培養模式的基礎上,發明了一種具有腫瘤抗原特異性 細胞毒性T淋巴細胞細胞(命名為i APA-DC-CTL細胞)培養方法。取150-200mL臍血或自體外 周血進行單個核細胞分離,貼壁2h分離培養DC細胞,未貼壁細胞于含IL-2的培養基中進行T 淋巴細胞預養。DC細胞經iAPA因子腺病毒感染誘導成熟后,收集成熟DC,按照DC:T為1:10的 效靶比刺激自體原初T淋巴細胞,使其分化為細胞毒性T淋巴細胞,觀察記錄CTL的增殖能 力、檢測CTL的細胞毒性。
[0014] 本發明的更優技術方案為:
[0015] 步驟(1)的主要操作為:
[0016] ①將采血袋經酒精浸潤的無塵紙擦拭潔凈后放入生物安全柜,利用50ml注射器抽 取血袋中的血液分裝到50ml離心管中,每管血液30ml,經2000rpm下離心10min;
[0017] ②離心后,將上層血漿置于一支新的50ml離心管中。吸至距分界面0.5cm處為止, 若剩余血細胞多于15ml,則取上層15ml血細胞置于新的離心管中,棄去底部剩余紅細胞;
[0018] ③用生理鹽水按照1:1的比例稀釋白細胞,取裝有15ml ficoll的離心管并傾斜, 緩慢的將混勻的血細胞加到ficoll液面上,使其呈清晰的界面,血樣與ficoll的比例不超 過2:1,于常溫1600rpm下離心20min;
[0019] ④離心后液面將分為4層,從底部分別為紅細胞、ficoll層、白膜層和上清液層,吸 棄上清液層,緩慢吸取白膜層細胞至新的50ml離心管中,加生理鹽水至45ml,混勻,1500rpm 下離心10min;
[0020] ⑤離心后棄上清,細胞沉淀先用5ml生理鹽水重懸,再加生理鹽水至45ml,混勻,取 樣用于計算細胞數量,1300rpm下離心10min;
[0021] ⑥離心后棄上清,用X-VIV015培養基將細胞密度調整為107/ml。
[0022] 步驟的(2)的主要操作為:
[0023] ①將細胞密度為107/ml的臍帶血單個核細胞按照106/cm2的細胞數量加入到培養 瓶中,37 °C、7.5 % C02濃度培養箱中培養;
[0024]②靜置培養2h后,輕輕晃動培養瓶,將未貼壁細胞晃起,吸走上層未貼壁細胞至于 新的培養瓶中,加入含GMCSF 1000U/ml、IL-4 1000U/ml的X-VIV0 15培養基,于37°C、7.5% C02濃度培養箱中培養;
[0025] ③第二天晃動培養瓶,將未貼壁細胞晃起,吸棄培養液,重新補入含GMCSF 1000U/ ml、IL-4 1000U/ml的X-VIV0 15培養基繼續培養;
[0026] ④每隔兩天半量換液,加入含GMCSF 1000U/ml、IL-4 1000U/ml的X-VIV0 15培養 基,第5天完成未成熟DC細胞的培養,收集細胞,取樣進行流式檢測細胞表型。
[0027]步驟(3)的主要操作為:
[0028]①收集培養至第5天的未成熟DC細胞,取樣計數,計算DC的總量,1500rpm,離心 lOmin;
[0029] ②離心后棄上清,加入含l〇〇〇U/ml GMCSF、1000U/ml IL-4和 100ng/ml TNF-α的X-VIVO 15培養基重懸細胞,將細胞密度調整為5X10%1,按照M0I為104vp/cell的病毒用量 加入細胞懸液,充分混勻,鋪于培養瓶中,37 °C、7.5 % C02濃度培養箱中培養;
[0030] ③培養48h后,收集懸浮細胞,將未懸浮細胞用細胞刮刀刮起,混勻兩種細胞為成 熟DC細胞,取樣計數,進行流式檢測細胞表型;
[0031] ④根據T細胞量確定DC需求量,將剩余的成熟DC重懸于含10%DMS0的FBS中,程序 降溫法進行凍存。
[0032]步驟(4)的主要操作為:
[0033]①原初T細胞的預養,單個核細胞中未貼壁細胞置于含1000U/ml IL-2的X-VIV0 15培養基中作為原初T細胞預養,每兩天補加培養基;
[0034]②收獲na'ive-T細胞,取樣計算T細胞總量。將DC與T細胞按照1:20的比例混合培 養,同時加入終濃度為l〇ng/ml的IL-7、2ng/ml的IL-15、lng/ml的IL-12,在含1000U/ml的 IL-2X-VIV0 15培養基中,于37°C,7.5%二氧化碳培養箱中培養;
[0035]③DC與T細胞共培養至第4天,復蘇凍存的DC細胞,加入到DC-T細胞混合培養體系 中,再次刺激T細胞生長,同時加入IL-7 10ng/ml、IL-15 2ng/ml、IL-12 lng/ml,在IL-2 1000U/ml的X-VIVO 15培養基中,37°C,7.5%二氧化碳中培養。
[0036]步驟(5)的主要操作為:
[0037] 待DC細胞與T細胞共同培養至第7天,將T細胞轉入含anti-CD3mAbs 5ug/ml、 antiCD28 mAbs 2ug/ml、IL-2 1000U/ml的X-VIVO 15培養基中進行擴增培養,并根據T細胞 生長情況進行補液,使Τ細胞生長密度保持為1 X 106/ml。
[0038]本發明中一些常用的術語說明如下:
[0039] GMCSF:巨噬細胞-粒細胞集落刺激因子,
[0040] IL-4:白細胞介素-4,
[0041] IL-2:白細胞介素-2,
[0042] anti-⑶3mAbs:細胞表面分子3單克隆抗體,
[0043] anti-CD28mAbs:細胞表面分子28單克隆抗體,
[0044] TNF-α :腫瘤壞子因子-α,
[0045] Μ0Ι:感染復數,
[0046] IL-12:白細胞介素-12,
[0047] IL-7:白細胞介素-7,
[0048] IL-15:白細胞介素-15。
[0049]本發明所述CTL細胞抗原特異性檢測方法為:在DC細胞將抗原呈遞給Τ細胞時,形 成HLA-抗原-TCR三聯體,T細胞上TCR識別的配體是抗原肽/MHC分子復合物,而不是天然的 抗原表位。因此,體外人工合成TCR結合的配體-HLA抗原肽四聚體(HLA-pept i de tetramer)。利用HLA-抗原肽四聚體和流式細胞分選儀能夠從淋巴細胞中分離出抗原特異 性的T細胞克隆,結合T細胞培養,能夠擴增相應的T細胞克隆。我們利用CD8-PE標記細胞毒 性Τ淋巴細胞和腫瘤特異性表面抗原survivin-HLA(LTLGEFLKL-HLA-A*02:01-APC)鑒定CTL 細胞腫瘤抗原survivin特異性。
[0050]本發明所述CTL細胞毒性檢測方法為:將效應細胞與癌細胞按一定比例(10:1,20: 1,50:1)混合共培養,24h后收集細胞,離心洗滌,進行流式細胞檢測CTL細胞毒性。正常細胞 的磷酯酰絲氨(phosphatidylserine,PS)位于細胞膜內表面,細胞凋亡(Apoptosis)時翻轉 露于膜外側,可與annexinV高親合力結合。將效應細胞與靶細胞充分共育后,用PE結合的效 應細胞特異性單克隆抗體(如⑶8-FITC)標記效應細胞,再用APC-annexin V標記凋亡靶細 胞,用流式細胞儀區分并定量此三類不同的細胞群,即可計算出效應細胞殺傷靶細胞百分 比。
[0051 ]本發明通過腺病毒轉染進行基因改造的腫瘤特異性樹突狀細胞,在體外激活擴增 獲得大量腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞,獲得更好的治療效果;能夠解決血液成分單采機 的限制,采集的血量少,減輕患者的負擔,并且能夠在體外觀察iAPA-DC刺激原初T細胞分化 為腫瘤特異性的細胞毒性T淋巴細胞,并對其增殖能力和細胞毒性進行檢測,避免了腫瘤細 胞對iAPA-DC可能產生的免疫逃逸。 (四)
【附圖說明】
[0052]下面結合附圖對本發明作進一步的說明。
[0053]圖1為經誘導5天的臍帶血來源的未成熟樹突狀細胞(200 X )示意圖;