一種豬脂肪干細胞分離培養及鑒定的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及動物細胞培養領域，尤其涉及一種豬脂肪干細胞分離培養及鑒定的方 法。
【背景技術】
[0002] 胚胎干細胞的研究遇到倫理、法律的瓶頸之后，成體干細胞日益成為研究的熱點。 間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于臍帶血、骨髓、肌肉、皮膚和脂肪 等組織中的一類成體干細胞，MSCs來源可靠，具有自我更新，且具有向多種組織分化潛能， 可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞。脂肪干細胞(Adipose-derived stem cells，脂肪干細胞) 是近年來從脂肪組織中分離得到的一類成體間充質干 細胞，具有自我更新及向分化潛能。脂肪干細胞由于具有安全、易獲得、可迅速擴增和多向 分化能力等特點使其成為現有干細胞生物工程研究的最理想來源。目前臨床上已利用這種 細胞進行基因治療、干細胞治療及骨組織工程的修復等，在再生醫學領域具有廣泛的應用 前景。
[0003] 2006年，國際細胞治療協會（間充質干細胞委員會）（Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy)認為人 類的MSCs的必須滿足以下三個條件：（1)在標準的細胞培養條件下，MSCs必須具備可貼壁性 生長；（2)MSCs應該高表達0)73、0)90、0)105 ;而應低表達或不表達0)14、0)45、0)1113、0)34、 CD79、CD 19以及人白細胞抗原(HLA-DR)。（ 3)在特定的誘導液培養下，MSCs必須具有向骨、月旨 肪和軟骨分化的能力。由于目前脂肪干細胞并沒有特定的表面標志，因此對它們的鑒定主 要采用流式細胞儀檢測細胞表面標志和將脂肪干細胞進行成脂、成骨和成軟骨的誘導分化 來確定它們是否為脂肪干細胞。這是目前公認的間充質干細胞鑒定方法。
[0004] 在現有技術中，豬脂肪干細胞在體外連續培養后，容易老化，核型發生改變、表面 抗原發生變化、且多向分化能力僅局限于向成骨或成骨和成脂肪細胞方向分化(Zhang et al.(2014).PLoS ONE 9(1)：e85089.doi：10.1371/journal. pone .0085089；Huang et al. Stem Cell Research&Therapy (2015)6:77)，沒有向成軟骨細胞方向誘導成功的報道。 脂肪干細胞的老化限制了其在脂肪組織工程及其他組織工程中研究和應用。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種遺傳穩定性好，干性好，多向分化性能好的 脂肪干細胞培養的方法。
[0006] 為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
[0007] -種豬脂肪干細胞分離培養的方法，包括以下步驟：
[0008] 1)將豬脂肪組織消化后進行細胞篩過濾，細胞篩過濾后進行梯度離心，所述的細 胞篩過濾和梯度離心重復兩次，然后進行細胞培養，
[0009] 所述消化采用Liberase TL進行，所述消化的溫度為37°C，時間為1~3h;所述的 Liberase TL的濃度為15~25yg/mL，Liberase TL與脂肪組織的體積比為Ο·5~1:1;
[0010] 2)將所述培養得到的細胞進行傳代培養。
[0011]優選的，步驟1)中所述的脂肪組織消化前還包括以下步驟：
[0012]采集豬脂肪組織；
[0013]將所述采集到的豬脂肪組織清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液為含有0.45~ 0.5g/L青霉素和0.6~1. Og/L鏈霉素的PBS溶液。
[0014]優選的，所述的脂肪組織消化后還包括終止消化，所述終止消化具體為：
[0015]使用含體積分數為7.5~15%FBS的低糖DMEM培養液終止消化，所述的低糖DMEM培 養液為葡萄糖含量低于l〇〇〇mg/L的DMEM培養液。
[0016] 優選的，所述的細胞篩過濾按照時間順序包括第一細胞篩過濾和第二細胞篩過 濾；
[0017] 所述第一細胞篩過濾中細胞篩的孔徑為100M，所述第二細胞篩過濾中細胞篩的 孔徑為70μηι。
[0018] 優選的，所述的梯度離心按照時間順序包括第一離心和第二離心；
[0019] 所述第一離心的轉速為1000~1400rpm，所述第一離心的時間為8~12min;
[0020] 所述第二離心的轉速為8000~1200rpm，所述第二離心的時間為8~12min。
[0021 ]優選的，所述傳代培養采用的培養液為含有體積分數為7.5~15 % %FBS的低糖 DMEM培養液，所述的低糖DMEM培養液為葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培養液。
[0022] 本發明還提供了一種豬脂肪干細胞的鑒定方法，包括以下步驟：
[0023] 將豬脂肪干細胞進行生物學特性鑒定、表面抗原檢測和誘導分化檢測。
[0024]優選的，所述生物學特性鑒定包括測定生長曲線、測定細胞集落和分析細胞核型。
[0025] 優選的，所述脂肪干細胞表面抗原檢測前還包括:將所述脂肪干細胞依次進行預 消化和消化；
[0026] 所述預消化采用Liberase TL進行，所述Liberase TL的濃度為15~25yg/mL，所述 預消化的溫度為37°C，所述預消化的時間為1~3min，
[0027] 所述預消化的環境中的C02的體積比例為5%，所述預消化的環境中的濕度為飽和 濕度；
[0028]所述消化采用胰蛋白酶和EDTA進行，所述胰蛋白酶的質量濃度為0.25 %，所述 Η)ΤΑ的質量濃度為0.03~0.05%，所述消化的溫度為37°C，C02飽和濕度為5%，所述消化的 時間為1~3min。
[0029] 優選的，所述的脂肪干細胞誘導分化檢測，包括以下步驟：
[0030] 培養豬脂肪干細胞，當細胞匯合度達到80 %-90%時，加入成脂誘導液、成骨誘導 液和成軟骨誘導液進行為期2~4周的成脂、成骨和成軟骨細胞誘導；
[0031] 將誘導培養到期的細胞分別進行油紅0、茜素紅和阿爾新藍染色；
[0032]將誘導培養到期的細胞進行成脂特異性基因 Ppar-2、成骨特異性基因 Osteocalcin和成軟骨特異性基因 Collagen II檢測；
[0033]所述的油紅0、茜素紅和阿爾新藍染色和所述的成脂特異性基因 Ppar-2、成骨特異 性基因 Osteocalcin和成軟骨特異性基因 Collagen II檢測之間無時間順序限定。
[0034]本發明的有益效果:本發明提供方法所得到的脂肪干細胞體外連續培養到15代， 細胞增殖力強，仍然保持遺傳穩定性;所得到的脂肪干細胞干性好，體外培養傳代到第18代 仍具有間充質干細胞表面抗原特性（CD90+、CD44+、CD29+、CD105+、CD31-、CD45mHLA-DR-);尤其是不表達HLA-DR，說明脂肪干細胞無免疫排斥反應;所得到的脂肪干細胞的多向 分化性能好，具有向成骨細胞、成軟骨細胞和成脂肪細胞分化的能力。本發明的方法操作簡 單、方便實用、可重復性強，建立了一套規范標準的豬脂肪干細胞的分離、培養和鑒定的方 法，為今后利用脂肪干細胞建立模式動物，研究人類疾病、器官移植、家畜常見疾病，以及在 提高優良家畜繁殖力，定向改造家畜遺傳性狀等研究奠定了基礎。
【附圖說明】
[0035]圖1為本發明實施例2廣西巴馬小型豬脂肪干細胞P3、P5、P10和P15不同代數下的 生長曲線；
[0036]圖2為廣西巴馬小型豬P3脂肪干細胞在21天時吉姆薩染液染色后得到的細胞集落 圖；其中A，B和C分別表不常光、顯微鏡40 X和100 X的不意圖；
[0037]圖3為廣西巴馬小型豬脂肪干細胞的核型分析圖（2n = 28);
[0038]圖4為豬脂肪干細胞向成脂、成骨和成軟骨方向分化圖；
[0039]圖5為廣西巴馬小型豬脂肪干細胞特異性基因檢測結果；其中，M1、M2、M3為 DL500Marker，2、5、8為陽性對照GAH)H(230bp)，3、6、9為空白對照；1:PPAR-2(238bp)，4: 0steocalcin(205bp),7：Collage II(240bp)；
[0040] 圖6為廣西巴馬小型豬脂肪干細胞P6代的表面抗原的流式檢測結果圖；
[0041] 圖7為廣西巴馬小型豬脂肪干細胞P12代的表面抗原的流式檢測結果圖；
[0042]圖8為廣西巴馬小型豬脂肪干細胞P18代的表面抗原的流式檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0043] 本發明提供了一種豬脂肪干細胞分離培養的方法，包括以下步驟：
[0044] 1)將豬脂肪組織消化、離心后進行細胞培養；
[0045] 2)將所述培養得到的細胞進行傳代培養。
[0046]本發明對所述豬的種類沒有特殊的限定，優選的為廣西巴馬小型豬，廣西巴馬小 型豬是廣西地方品種豬，其體型小，解剖結構、組織、生理等方面與人類相似，是較好的實驗 動物模型。
[0047]本發明將豬脂肪組織進行消化，優選在消化前進行如下步驟：
[0048]采集豬脂肪組織；
[0049] 將所述采集到的豬脂肪組織清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液為含有0.45~ 0.5g/L青霉素和0.6~1. Og/L鏈霉素的PBS溶液。
[0050] 本發明優選的首先采集豬脂肪組織，所述采集優選具體為：
[0051]用體積分數為75%酒精消毒廣西巴馬小型豬的腹部，然后從腹部采集脂肪組織。 [0052]采集到豬脂肪組織后，本發明將所述采集到的豬脂肪組織清晰后剪碎。在本發明 中，所述清洗用清洗液優選為含有〇. 45~0.5g/L青霉素和0.6~1. Og/L鏈霉素的PBS溶液， 所述的PBS溶液的pH值優選為7.2~7.4，更優選的為7.3;所述清洗的次數優選為2~4次；
[0053]本發明將清洗干凈后的脂肪組織優選剪碎成1 X 1 X (1~3)_的小塊。
[0054] 得到小塊脂肪組織后，本發明優選將所述小塊脂肪