一種具有廣譜農藥降解特性的聚多曲霉的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于環境生物技術領域，具體涉及一株具有廣譜農藥降解特性的真菌聚多 曲霉PA F-2。
【背景技術】
[0002] 農藥的廣泛使用，在給農業生產帶來快速高效的作物產量的同時，也給水體、土壤 和大氣環境造成了嚴重的污染，還增加了農產品的產品安全問題。目前常用的農藥修復方 法是爐窯焚燒、熱脫附和化學處理等方法，但存在費用高，修復困難，容易造成二次污染等 情況。利用水體和土壤中能夠將有機農藥作為能源物質，并將其降解為無毒或者低毒化合 物的生物(主要為微生物)所建立的生物修復法，被公認為是一種高效、安全、無污染和廉價 的修復方式，同時，因為微生物在環境中的種類豐富多樣、分布廣泛、適應性強、易馴化易突 變等特點，在當前的農藥生物修復中具有較好的優勢。
[0003] 我國當前工業場地中常常存在復合型農藥污染，且農藥種類多元化，而當前研究 得到的高效農藥降解微生物多為特異性的，即只對一種農藥或者一類農藥(如有機磷類或 者菊酯類農藥)發生降解作用，在復合農藥污染的工業場地土壤修復中存在明顯的缺陷。同 時，只具有特異性農藥降解的微生物在復合農藥污染場地中，由于對其它多種有毒有機農 藥缺乏耐受性，因而無法實現對農藥的高效降解。同時，有機農藥多具有對映體，這些具有 手性對映體結構的有機物在環境中常常會產生選擇性環境行為，在環境中的消解和歸宿會 產生很大差異，并且生物活性也往往存在差異。具有廣譜農藥降解特性的微生物，既可以對 多種農藥保持耐受性，還能同時以多種農藥為能源物質，對多種農藥進行降解作用，然而這 方面的報道很少。
【發明內容】
[0004] 本發明的第一個目的是提供一種從湖北省蘄州鎮蘄農化工有限公司新廠區周邊 植物根際、非根際土樣和水樣中篩選得到，對多種有機磷類、有機氯類、菊酯類和苯氧類等 農藥具有高耐受性和高效降解性的真菌:聚多曲霉(Aspergillus sydowii)PA F-2,該菌于 2015年9月7日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學，保藏號為 CCTCC N0.M2015513。
[0005]該菌株的生物學特征主要有:該菌在液體和固體發酵培養基中的生長周期較長。 液體發酵培養基搖床振蕩培養48小時內達到對數生長期，培養5天內達到穩定期，發酵液澄 清，真菌菌絲形成綠色或深綠色球狀;在固體PDA培養基上，該菌菌落大小不規則，邊緣為白 色絨毛狀，成熟菌落中心顯綠色，氣生菌絲和基生菌絲發達，易挑取。菌落為不規則圓形，表 面粗糙，扁平隆起，無光澤;半濕潤，易挑起;不透明白色，邊緣為綠色環形;菌落較大，邊緣 不整齊。在光學顯微鏡下觀察，菌絲較細呈網狀，直徑約為〇.15μπι;孢子顏色為褐色，形狀為 圓形，直徑約為O.lOwii;孢子梗細長，直徑均勻，分枝明顯，叉狀銳角分枝，分枝不相對稱。
[0006] 從菌株聚多曲霉PA F-2的純培養物中提取基因組DNA，運用rDNA內轉錄間隔區 (ITS)序列特定的引物ITS1/ITS4,通過PCR擴增，得到543bp長度的擴增產物，擴增產物經測 序公司進行序列測定，其序列如SEQ ID NO. 1所示。將序列與GenBank中的序列進行BLAST比 對，結果表明該菌株與聚多曲霉（Aspergillus sydowii)同源性很高，其相似度達到 99.6%。同時結合生理生化測試和形態結構觀察結果分析，該菌株確定為聚多曲霉 (Aspergillus sydowii)。
[0007] 該菌株的廣譜農藥降解特性:在固體平板檢測實驗中，該菌株PA F-2能在以13種 當前常見的農藥及中間合成物，有機磷:敵百蟲、草甘膦、敵敵畏;有機氯:百草枯;菊酯類： 高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、聯苯菊酯;酰胺類:乙草胺;芳氧苯氧羧酸酯類:精喹禾 靈;苯氧類:2，4-D，苯氧基苯甲酸;苯環類:鄰氯苯酚;作為固體培養基唯一碳源、唯一氮源 或者磷源(含有氮元素的農藥作為唯一氮源，含有磷元素的農藥作為唯一磷源）以及唯一碳 氮源或者碳磷源的培養基上正常生長，且生物量高，生長速率非常快。
[0008] 在液體搖瓶實驗中，該菌株在以苯氧類農藥2,4-D、有機磷類農藥敵百蟲、菊酯類 農藥高效氯氰菊酯為惟一碳源的培養基中，生長速率非常快，降解率高。在培養48小時內完 全降解2,4-D，培養5天內完全降解高效氯氰菊酯，14天內對敵百蟲的降解率超過80%。
[0009] 因此，本發明的第二個目的是提供聚多曲霉PA F-2在降解農藥方面的應用，這13 種農藥是有機磷:敵百蟲、草甘膦、敵敵畏;有機氯:百草枯;菊酯類:高效氯氰菊酯、溴氰菊 酯、甲氰菊酯、聯苯菊酯；酰胺類：乙草胺;芳氧苯氧羧酸酯類:精喹禾靈;苯氧類:2，4-D，苯 氧基苯甲酸;苯環類:鄰氯苯酚。
[0010]由于目前國內外在廣譜農藥降解微生物的研究非常少，因此本發明篩選出的能降 解13種農藥的聚多曲霉PA F-2在農藥污染的水體環境治理、土壤環境治理以及當前工業場 地復合農藥污染的綜合治理中具有非常高的應用價值。
【附圖說明】
[0011]圖1是聚多曲霉PA F-2在光學顯微鏡下的孢子和孢子梗圖；
[0012]圖2是聚多曲霉PA F-2在rDNA內轉錄間隔區（ITS)無根系統發育樹中位置圖；
[0013] 圖3是聚多曲霉PA F-2在以有機氯農藥百草枯、有機磷農藥敵百蟲及敵敵畏和菊 酯類農藥高效氯氰菊酯為能源物質的固體平板上的生長情況圖；
[0014] 圖4是響應球面分析方法分析聚多曲霉PA F-2在不同溫度和pH值條件下的敵百蟲 降解率圖。
[0015]對于保藏真菌的生物學特性說明：
[0016] 該真菌保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC N0.M2015513。地址：中 國.武漢.武漢大學，拉丁學名:Aspergillus sydowii，中文名稱為：聚多曲霉，該菌于2015 年9月7日保藏。
【具體實施方式】
[0017] 通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施 例僅是對本發明方法的說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其余內容。
[0018] 【實施例1】廣譜農藥降解菌的篩選
[0019] 實驗土樣和水樣均采自于湖北省蘄州鎮蘄農化工有限公司新廠區周邊植物根際 和非根際土樣，水樣也采自于該廠區的5個排水口，土樣和水樣采集后，回實驗室立即放于-20 °C保存，以殺死土壤中的昆蟲和植物組織以及一些病毒。處理10小時之后，于4°C解凍，多 余的土樣置于4°C冰箱保存。取10g 土樣或者10mL水樣，加入100mL滅菌的液體富集培養基 (含無菌玻璃珠）（富集培養基成分：蛋白胨10g/L，NaC11.0g/L，KH 2P031.0g/L，pH = 7)， 150rpm振蕩7天。培養1周后，取富集培養基中的培養液10mL，分別加入含有50mg/L敵百蟲 (TR)、馬拉硫磷(MA)、百草枯(PA)、林丹(Lin)和高效氯氰菊酯(β-CP)的富集培養基中，再于 相同溫度和振蕩條件下培養1周。依次方式，按照濃度50，100，200，400和500mg/L馴化，