一種天然酪蛋白多孔水凝膠材料及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫用水凝膠材料制備技術領域，具體涉及一種天然酪蛋白多孔水凝膠材料及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]作為一類重要的細胞支架材料，多孔水凝膠在組織工程領域應用廣泛、發展潛力巨大。這不僅是因為水凝膠本身具有與生物組織中的細胞外基質相似的結構和親水性，而且其多孔結構和孔連通性能夠為細胞的生長、增殖、迀移以及組織生長所需營養物質與組織代謝物的傳遞提供有利的條件和環境。如何設計制備出生物相容性好、孔結構易于調控且孔連通性能優良的多孔水凝膠細胞支架材料，是目前生物醫學工程領域的研究熱點和重要課題。
[0003]迄今為止，用于多孔水凝膠的制備方法主要有發泡法、相分離法和鹽析法，但基于這些方法制得的水凝膠的孔結構通常不易調控、且孔間連通性較差。相比之下，近年來出現的高內相乳液模板法，則可望為性能優良的多孔水凝膠支架材料的制備提供一條有效途徑。一般而言，高內相乳液的內相體積分數可高達75%、甚至99%，通過交聯固定這種乳液的連續相然后除去內相，便可獲得高孔隙率的多孔材料;不僅如此，通過調節內相體積分數，還可有效控制所得水凝膠的孔隙率及孔徑。然而，目前利用高內相乳液模板法制備多孔水凝膠支架的研究工作，尚存在以下主要問題:一是制備時大多使用丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥乙酯等聚合單體作為基本原材料，不僅導致所形成的水凝膠基質難以生物降解，而且易殘留導致生物毒性;二是為形成有關高內相乳液模板，普遍添加了大量的有機表面活性劑作為穩定劑，致使所制備的多孔水凝膠材料的生物安全性降低。
【發明內容】
[0004]為了克服現有技術的不足與缺點，本發明的首要目的在于提供一種天然酪蛋白多孔水凝膠材料的制備方法，該方法以利用天然酪蛋白的自乳化能力制備的高內相乳液為模板，在連續相中加入H3C/NHS催化酪蛋白間的氨基和羧基的酰胺化交聯反應。
[0005]本發明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的天然酪蛋白多孔水凝膠材料，該水凝膠材料生物相容性好、具有連通孔、孔結構和孔隙率可控。
[0006]本發明的再一目的在于提供上述天然酪蛋白多孔水凝膠材料的應用。
[0007]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0008]—種天然酪蛋白多孔水凝膠材料的制備方法，包含如下步驟:
[0009](I)將酪蛋白水溶液作為水相與油相混合，得到0/W高內相乳液；
[0010](2)將步驟(I)制得的0/W高內相乳液與EDC.HCl和NHS混合水溶液混合，進行酰胺化反應;然后除雜，得到酪蛋白多孔水凝膠；
[0011 ]步驟(I)中所述的酪蛋白水溶液，優選通過如下制備方法制備得到:
[0012]將酪蛋白加入水中，用堿溶液調pH至7.5?9.5，得到酪蛋白水溶液;所述的堿溶液優選為氫氧化鈉溶液；
[0013]步驟(I)中所述的酪蛋白水溶液的質量分數優選為8.0%?12.5%;
[0014]步驟(I)中所述的水相和油相的體積比為(1:3)?(1:9);
[0015]步驟(I)中所述的油相為正己烷、甲苯、橄欖油中的任意一種；
[0016]步驟(I)中所述的混合優選攪拌條件下混合；
[0017]所述的攪拌的速度優選為1000rpm;
[0018]步驟(2)中所述的EDC.HCl和NHS混合水溶液中NHS、EDC.HCl與0/W高內相乳液中酪蛋白的質量比優選為9:15:50；
[0019]步驟(2)中所述的EDC.HCl和NHS混合水溶液的體積與步驟(I)中所述的的水相體積比為1:10;
[0020]步驟(2)中所述的酰胺化反應的條件優選為4?25°C反應12?48h;
[0021]步驟(2)中所述的酰胺化反應的條件進一步優選為4°C反應24h;
[0022]步驟(2)中所述的除雜的方式優選為透析或者抽提；
[0023]所述的抽提的條件優選為體積分數為60?80%的乙醇水溶液和水分別抽提12?48h；
[0024]—種天然酪蛋白多孔水凝膠材料，通過上述制備方法制備得到；
[0025]所述的天然酪蛋白多孔水凝膠材料優選具有如下特征:有連通孔、孔徑分布為5?120μπι且孔隙率大于75%;
[0026]所述的天然酪蛋白多孔水凝膠材料在組織工程領域中的應用；
[0027]所述的天然酪蛋白多孔水凝膠材料不僅生物相容性好、可降解，而且其孔徑及孔隙率易于調控，適合用作生物組織工程細胞支架材料；
[0028]本發明的原理:本發明以來源豐富、可再生且具優良生物安全性和可生物降解性的天然酪蛋白為基本原材料，同時在不外加有機表面活性劑情況下，利用天然酪蛋白的自乳化能力原位形成高內相乳液模板，再利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)催化酪蛋白的羧基和氨基發生酰胺化反應而使連續相內的酪蛋白交聯形成三維網絡結構，制備得到一種生物相容性好、具有連通孔且孔結構易調控的多孔水凝膠細胞支架材料。
[0029]本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:
[0030](I)本發明采用的主要原料為來源豐富、可再生且具優良生物安全性和可生物降解性的天然酪蛋白。
[0031](2)本發明在不外加有機表面活性劑情況下，利用天然酪蛋白的自乳化能力原位形成高內相乳液模板。
[0032](3)本發明制備的多孔水凝膠可通過油水相體積比控制孔徑及孔隙率，并具有連通孔結構。
[0033](4)本發明對設備要求低，適用性廣。
【附圖說明】
[0034]圖1是實施例1制得的高內相乳液的的宏觀狀態和微觀形貌圖。
[0035]圖2是實施例1制得的酪蛋白多孔水凝膠材料的光學顯微鏡形貌圖。
[0036]圖3是實施例1制得的酪蛋白多孔水凝膠材料的宏觀狀態和掃描電鏡圖。
[0037]圖4是實施例1制得的酪蛋白多孔水凝膠材料用作鼻咽上皮細胞NP69培養支架，細胞培養Sh后及24h后的細胞活/死細胞染色結果分析圖；其中，A: Sh; B: 24h。
[0038]圖5是實施例1制得的多孔水凝膠的細胞相容性評價分析圖。
[0039]圖6是實施例2制得的高內相乳液的宏觀狀態和微觀形貌圖。
[0040]圖7是實施例2制得的酪蛋白多孔水凝膠材料的光學顯微鏡形貌圖。
[0041 ]圖8是實施例2制得的酪蛋白多孔水凝膠材料的宏觀狀態和掃描電鏡圖。
[0042]圖9是實施例2制得的酪蛋白多孔水凝膠材料用作鼻咽上皮細胞NP69培養支架，細胞培養8小時后及24小時后的細胞活/死細胞染色結果分析圖；其中，A:8h;B:24h。
[0043]圖10是實施例2制得的多孔水凝膠的細胞相容性評價分析圖。
[0044]圖11是實施例3制得的高內相乳液的宏觀狀態和微觀形貌圖。
[0045]圖12是實施例3制得的酪蛋白多孔水凝膠材料的光學顯微鏡形貌圖。
[0046]圖13是實施例3制得的酪蛋白多孔水凝膠材料的宏觀狀態和掃描電鏡圖。
[0047]圖14是實施例3制得的酪蛋白多孔水凝膠材料用作鼻咽上皮細胞NP69培養支架，細胞培養8小時后及24小時后的細胞活/死細胞染色結果分析圖；其中，A:8h;B:24h。
[0048]圖15是實施例3制得的多孔水凝膠的細胞相容性評價分析圖。
【具體實施方式】
[0049]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0050]實施例1
[0051 ] (1)0.1g酪蛋白加入水中，用氫氧化鈉溶液調pH至8.0，配制1wt%的酪蛋白水溶液；
[0052](2)將ImL步驟(I)制得的酪蛋白水溶液(水相)與4mL正己烷(油相)混合，在
IOOOOrpm條件下攪拌，得到0/W高內相乳液；
[0053](3)將步驟(2)制得的0/W高內相乳液與0.lmL含0.03g EDC.HCl和0.018g NHS的水溶液混合并攪拌混勻，置于4°C下反應24h，用體積分數為65%的乙醇水溶液和水分別抽提24h，得到天然酪蛋白多孔水凝膠材料；
[0054]圖1A為步驟(2)制得的酪蛋白穩定的高內相乳液的宏觀狀態圖，如圖所示，為乳白色粘稠乳液;在光學顯微鏡下觀察乳液的微觀形貌，結果如圖1B所示:液滴間呈密堆積，具有典型的尚內相乳液特點；
[0055]利用光學顯微鏡觀察步驟(3)制得的天然酪蛋白多孔水凝膠材料的形貌，結果如圖2所示:水凝膠具有圓形的拓撲結構，是高內相乳液模板的作用；
[0056]圖3A為步驟(3)制得的天然酪蛋白多孔水凝膠材料的宏觀狀態圖；用液氮對步驟(3)制得的水凝膠材料進行冷凍處理，真空凍干機干燥，用掃描電鏡(SEM)S-4800(日本JEOL公司)觀察天然酪蛋白多孔水凝膠材料的孔形貌，并測定其孔徑，結果如圖3B所示:水凝膠具有連通孔結構，孔徑范圍在5?120μπι;使用乙醇置換法測得孔隙率為82.5%；
[0057]細胞增殖觀察:用KSF培養液培養ΝΡ69鼻咽上皮細胞(購自上海信裕生物技術有限公司)24小時至對數生長期，將天然酪蛋白多孔水凝膠材料置于24孔板，用聚四氟乙烯環固定;在其中接種對數生長期細胞，每孔I X 14個細胞;37°C培養8小時和24小時后，吸棄上清液，用PBS清洗2次；向板內(含ImLPBS液)加入1yL質量分數為0.01 %的AO/EB