抑制血管生成活性的化合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及海參共附生真菌發酵制備具有抑制血管生成作用的代謝產物1-氧-2-(2-(2-羥基異丙醇)-2,3-二羥基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羥基苯酚)-4-羥基-5-羰 基-2，5-二氫呋喃的制備及其在抑制血管生成活性的應用。
【背景技術】
[0002]海參作為重要的藥食同源海洋生物，含有豐富的活性物質，如海參皂苷、海參多 糖、海參多肽、神經節苷脂等，具有非常高的營養價值。海參共附生微生物和海參長期共存， 共同進化，抵御海里惡劣的環境，可能進行基因交換，進而能夠產生結構新穎、藥理活性強 的化合物。海參共附生真菌種類豐富，已經報道的代謝產物有苯并呋喃類化合物，生物堿類 化合物、聚酮類化合物和萜類化合物，生物活性主要有抗腫瘤活性、抑制乙酰膽堿酶活性和 α_糖苷酶等活性，引起了化學家和藥物研究者的高度重視。但是海參共附生真菌來源的抑 制血管生成活性的化合物除了本課題組之前報道的苯并呋喃類化合物外，還未見報道。本 專利申請的化合物，1-氧-2-(2-(2-羥基異丙醇)-2,3_二羥基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯Ια-羥基苯酚 )-4-羥基-5-羰基-2 ， 5-二氫呋喃， 且該菌代謝該化合物的量大 （ 100 yg/L) ， 利 用斑馬魚模型發現具有較強的抑制血管生成活性，在抑制血管生成為機理的抗腫瘤領域具 有廣闊的前景。
[0003]腫瘤是嚴重威脅人類健康的一類常見疾病。腫瘤血管生成與腫瘤生長、侵襲和轉 移等特性密切相關。由于腫瘤血管內皮細胞處于高度生長狀態，藥物選擇性高;其細胞基因 組穩定，不容易產生多藥耐藥性；以及各種腫瘤血管基因內皮細胞差異較小，同一藥物可能 對不同腫瘤有療效，因此理想的腫瘤血管生成抑制劑具有高效、低毒、無耐藥性并且具有抗 廣譜瘤等特點。通過抑制血管新生血管生成治療腫瘤已經成為一種廣泛而被深入研究的新 興治療手段。
【發明內容】
[0004] 本發明涉及一種利用海參共附生真菌發酵制備代謝產物：1_氧-2-(2-(2-羥基異 丙醇)-2，3-二羥基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羥基苯酚)-4-羥基-5-羰基-2，5-二氫呋 喃的制備工藝、結構以及抑制血管生成的藥理活性。
[0005] 本發明從海參的共附生真菌的發酵培養物中提取分離得到抑制血管生成的化合 物，它的結構式是：
白色膠狀，核磁和高分辨質譜的物化參數是： Mffi(CDCl3): δΗ 3.36(2H，s，H-6)，3.63 (3H，s，CH30-5)，6.62 (1H，br s， H-2'）， 6·46(1Η， d， 8·1Ηz， H-5'）， 6.57 (1H， br d， 8·3Ηζ， H-6'）， 2·98(1Η， dd， J =15.9， 8.2 Hz, H-7，a)， 2.88(1H， dd， 16.2， 9.4 Hz, H-7，b)， 4.43(1H， t， 8.9Hz, H-8'），1.23(3H, s, H-10'），1.06(3H, s, Η-1Γ), 7.74(2H, d, 8.4Hz, H-2''/H-5，，）· 13CNMR(CDC13):Sc171.8(C-1)，138.2(C-2)，128.1(C-3)，84.6(C-4)，171.8(C-5)，38.7(C-6)，52.8(CH3〇-5)，125.8(C-l'），129.7(C-2'），126.9(C-3'），158.5(C-4'）， 107.7(C-5'）， 126.6(C-6'）， 29.9(C-7'）， 89.0(C-8'）， 70.0(C-9'）， 26.0(CH3， C-10)，25.0(CH3，C-ir)，121.2(C-l，，），129.6(C-2，，/C-6，，），115.2(C-3，，/C-5''）， 158.6 (C-4''）· HRES 頂S:[M + H]+ 441.1505。
[0006] -種抑制血管生成活性的化合物的制備方法，其特征是它包括如下步驟： 1) 制作種子培養液:將土曲霉Aspergillus terreus菌株斜面接種于葡萄糖、蛋白胨、 酵母浸膏培養基中：pH: 6.5-7.5，在溫度25-30 °C、轉速150rpm、培養120h，獲得種子培養液； 2) 發酵罐發酵生產:將500-1000毫升種子培養液轉入發酵培養基，利用30升發酵罐在 25-30 °C條件下發酵72-96小時;發酵培養基:葡萄糖0.5-2，酵母提取物，0.05-0.2，蛋白 胨0.1-0.4，氯化鈉3-6，海水100(以上為重量比）。通氣量0.3-0.5(體積比，通氣量/發酵體 積），轉速100-140 rpm;將種子培養液接入發酵培養基，于室溫25-30°C發酵72-96h，得到發 酵液。
[0007] 將發酵液經紗布過濾和離心去除菌體，將菌體利用甲醇浸泡，發酵液利用大孔樹 脂吸附，然后利用100%乙醇洗脫得到洗脫液，洗脫液濃縮得到浸膏;浸膏利用以硅膠為固定 相，以30-50%石油醚/乙酸乙酯為流動相進行洗脫;然后利用Sephadex LH-20為固定相，以 石油醚/二氯甲烷/甲醇=1:1:1為流動相進行洗脫，得到1-氧-2-(2-(2-羥基異丙醇)-2,3_ 二羥基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羥基苯酚)-4-羥基-5-羰基-2，5-二氫呋喃。
[0008] -種抑制血管生成活性的化合物的應用，其特征是1-氧-2-(2-(2-羥基異丙醇)_ 2，3-二羥基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羥基苯酚)-4-羥基-5-羰基-2，5-二氫呋喃在制 備抑制血管生成生物活性方面的藥物中的應用。
[0009]結構確定:利用高分辨核磁波譜數據結合高分辨質譜，確定了 1-氧-2-(2-(2-羥基 異丙醇)_2，3-二羥基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羥基苯酚)-4-羥基-5-羰基-2，5-二氫 呋喃的結構。
[0010] 本發明具有以下有益效果，實驗證明1-氧-2-(2-(2-羥基異丙醇)-2,3_二羥基苯 并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羥基苯酚)-4-羥基-5-羰基-2，5-二氫呋喃在100 yg/mL時，體 間血管數為14.60 ± 3.71，抑制率為43.4%;在10 yg/mL時，體間血管數為19.20 ± 2.58， 抑制率為25.6%;在1 yg/mL時，體間血管數為22.80 ± 1.79,抑制率為11.6%，具有顯著性 差異，因此1-氧-2-(2-(2-羥基異丙醇)-2,3_二羥基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羥基苯 酚)-4-羥基-5-羰基-2，5-二氫呋喃具有顯著抑制血管生成的活性，且在測定濃度范圍內該 化合物顯示出較好的量效的關系，發酵工藝簡單，可以大規模制備，具有用于抗腫瘤藥物的 前景。
【具體實施方式】
[0011]實施例1:菌株的獲得:將威海成山頭海域仿刺參表皮切成lcm X 1cm的小塊，利用 TOA培養基添加硫酸鏈霉素和氨芐青霉素，25-30 °C培養7-14天，挑選純的菌株，并利用分子 生物學手段結合形態鑒定確定土曲霉(Aspergillus terreus)。
[0012] 所述海參來源的土曲霉Aspergillus terreus，菌落培養初期淺土黃色，漸變為深 土黃色，菌落反面呈暗黃色至棕褐色;分生孢子頭初為球形，繼而成為致密的直柱形。
[0013] 土曲霉菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保 藏編號為:CGMCC No. 11545。地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研 究所;郵編100101。保藏日期:2015年11月9日，該生物材料的分類命名及拉丁文名稱：土曲 霉（Aspergillus terreus)。
[0014] 實施例2: -種抑制血管生成活性的化合物的制備方法，其特征是它包括如下步 驟： 1) 制作種子培養液:將土曲霉Aspergillus terreus CGMCC No. 11545菌株斜面接種 于葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏培養基中：pH:6.5-7.5,在溫度25-30°C、轉速150rpm、培養 120h，獲得種子培養液； 2) 發酵罐發酵生產:將500-1000毫升種子培養液轉入發酵培養基，利用30升發酵罐在 25-30 °C條件下發酵72-96小時;發酵培養基:葡萄糖1，酵母提取物，0.1，蛋白胨0.2,氯化 鈉4，水10