法尼醇x受體的抑制劑和在醫學中的用圖
【專利說明】法尼醇X受體的抑制劑和在醫學中的用途
[0001] 對相關申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求2013年8月1日提交的美國臨時專利申請號61/861，109和2014年5 月29日提交的美國臨時專利申請號62/004,436的權益，所述臨時申請通過參考結合于此。
[0003] 發明背景
[0004] 肥胖已經達到世界范圍的流行比例，并且與慢性疾病如2型糖尿病、屯、血管疾病、 脂肪肝和癌癥相關。由于能量攝入超過能量消耗，導致過量的熱量在脂肪組織中W脂肪形 式凈儲存，造成肥胖形成。肥胖在代謝上與2型糖尿病(膜島素抗性)和脂肪肝關聯，后者可 W導致脂肪肝炎、肝癌發生和肝衰竭。因此，抑制食欲、阻斷膳食脂肪吸收、誘導脂肪遷移或 增加代謝的藥學方法在治療肥胖和相關代謝病癥方面是理想的。
[0005] 法尼醇X受體(Farnesoid X Receptor，FXR)是孤兒核受體，最初從大鼠肝cDNA文 庫中鑒定(Forman，等人，Cel 1 81:687-693，1995 )，其與昆蟲蟻皮激素受體最密切相關。FXR 是包括類固醇，類視黃醇和甲狀腺激素的受體的轉錄因子核受體超家族的成員 (Mangelsdorf，等人，Cell 83:841-850,1995) dRNA印跡和原位雜交分析顯示，FXR最大量地 表達在肝、腸、腎和腎上腺中（B.M. Forman,等人，Cell 81:687-693.1995; Seol，等人， Mol.Endocrinol. 9:72-85，1995) dFXR是配體激活的核受體，其作為與由維生素 A衍生物9- 順式視黃酸激活的視黃酸受體a(RXRa)的異二聚體結合DNA"FXR/RXRa異二聚體優選結合于 由W反向重復編排并且由單個核巧酸分開的共有AG(G/T)TCA(IR-1基序）的兩個核受體半 位點組成的應答元件(Forman,等人，Cell 81:687-693,1995)。早期的報道顯示，大鼠 F邸由 微摩爾濃度的法尼醇如法呢醇和保幼激素激活，因此導致最初的名稱(Forman,等人，Cell 81:687-693,1995)。然而，運些化合物是弱的配體并且也未能激活相應的小鼠和人FXR，造 成內源FXR配體的性質存在疑問。然而，發現多種天然存在的膽汁酸在生理濃度結合并激活 FXR(MakisMma，等人，Science 284:1362-1365,1999;化rks，等人，5(^611。6 284:1365- 1368，1999;Wang等人，Mol.Cell 3:543-553，1999 ;PCT W000/37077，2000年6月29 日公開）。 充當FXR配體的膽汁酸包括碟去氧膽酸(CDCA)，脫氧膽酸(DCA)，石膽酸化CA)，和牛橫酸W 及運些膽汁酸的甘氨酸綴合物。
[0006] 膽汁酸是在肝中形成的并且分泌到腸的十二指腸中的膽固醇代謝物，在那里，它 們在溶解和吸收膳食脂肪和維生素方面發揮重要作用。約95%的膽汁酸隨后被重新吸收到 回腸中并且經由腸肝(enterohepatic)循環體系返回肝。膽固醇在肝中轉變為膽汁酸在反 饋調節下，并且膽汁酸下調細胞色素 P450 7AUCYP7A1)的轉錄，細胞色素 P450 7A1 (CYP7A1)編碼催化膽汁酸生物合成中的限速步驟的酶。F邸通過設及F邸祀基因小異二聚體 伙伴（SHP)和肝受體同系物1的間接機制參與膽汁酸對CYP7A1表達的抑制（Goodwin等人， Mol.Cell 6:517-528,2000;在Matsubara等人，Mol.Cell.Endocrinol.368:17-29,2013中 綜述）。在回腸中，WFXR依賴性的方式，膽汁酸誘導腸膽汁酸結合蛋白（IBABP)的表達，腸膽 汁酸結合蛋白（IBABP)是W高親和力結合膽汁酸并且可W參與它們的細胞攝取和運輸的細 胞質蛋白。兩個小組現在已經證明，膽汁酸通過激活結合在人、大鼠和小鼠 IBABP基因啟動 子中保守的IR-1型應答元件的FXR來介導它們對IBABP表達的影響。因此，FXR設及到參與膽 汁酸和膽固醇穩態的祀基因的刺激（IBABP)和表達(CYP7A1)二者當中。FXR還誘導將未綴合 的和綴合的膽汁酸/鹽從肝細胞轉運到膽汁中的膽鹽輸出累（BSEP，ABC11)的表達（在 Matsubara等人，Mol .Cell .Endocrinol .368:17-29,2013中綜述）。
[0007] 報道了 tempol(4-^基-2,2,6,6，-四甲基贓晚-1-氧基），一種抗氧化劑和福射保 護劑，在小鼠中預防肥胖(Mitchell等人，Free Radic.Biol Med.34:93-102,2003)。最近的 基于質譜的研究表明，tempol可W影響脂肪酸代謝并且猜測的腸道微生物-產生的代謝物 的改變的水平提供tempol可W改變微生物群系（microbiome)的初步線索化i等人， J.Proteome Res.，12:1369-1376,2013)。之前的研究表明，腸道微生物群系的改變可W影 響肝、屯、臟和腎中膽汁酸的水平（Swann等人，Proc.化tl. Acad. Sci.USAlOS :4523-4530, 2011)。高脂肪膳食可W誘導小腸中受核受體(包括FXR)控制的基因的表達的改變(de Wi t 等人，BMC Med. Genomics 1:14，2008)。因此，腸中的改變的膽汁酸和可W改變高脂肪膳食 誘導的肥胖的F邸信號轉導之間可能存在關聯。盡管存在已知的天然和合成的FXR激動劑， 但還沒有公開括抗FXR的治療劑。近期的研究表明，次級膽汁酸牛橫-β-鼠膽酸(邱MCA)可W 括抗腸中膽汁酸信號轉導（Sayin等人，Cell 161曰6.225-235,2013;^等人，化1.(：〇臟1111.4: 2384，2013)。已經合成^取代的化挫甲酯胺類似物，其是FXR括抗劑，但是它們對代謝和生 理學的影響未被研究(化等人，Bioorg.Med. Chem. 2919-2938,2014)。
[0008] 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)特征在于在沒有其他肝疾病或顯著酒精消費的情況下 在肝中的大量的異位甘油Ξ醋(TG)積累（WdB等人，〇*3油.4防*66.1111*.2014;111:447- 452，2014) dNAFLD是最常見的肝病癥，其影響世界上20-30%的成年群體和多于80%的肥胖 的人。NAFLD可W發展為非酒精性脂肪肝炎（NASH)、纖維化、肝硬化和甚至肝細胞癌 (化owning等人，J.Clin Invest. 114:147-152,2004)。作為代謝綜合征的組成部分，NAFLD 與肥胖、膜島素抗性/2型糖尿病和冠屯、病和動脈粥樣硬化密切相關（Bhatia等人， Eur.Head J. 33:1190-1200,2012)。至今，NAFLD發展的潛在分子機制仍然很大程度上未知 并且鑒定NAFLD治療的新的祀點具有高的優先級。
[0009] 在前所述表明，存在未滿足的對于FXR受體的括抗劑和治療肥胖患者W誘導重量 減輕、膜島素抗性、和NAFLD的方法的需求。
[001日]發明概述
[0011] 本發明提供治療或預防哺乳動物，尤其是人中肥胖的核受體法尼醇X受體的抑制 劑。體現本發明的各方面的化合物通過法尼醇X受體介導的信號轉導抑制法尼醇X受體并且 影響高脂肪膳食誘導的肥胖。根據本發明，本發明提供包含運些化合物的組合物和在治療 或預防肥胖中使用運些化合物作為治療劑的方法。
[0012] 本發明還提供藥物組合物，其包含體現本發明的原理的化合物或鹽和藥用載體。
[0013] 本發明還提供抑制哺乳動物中法尼醇X受體的方法，其包括向需要其的哺乳動物 施用體現本發明的原理的化合物或其藥用鹽。
[0014] 本發明此外提供在哺乳動物中治療或預防肥胖的方法，其包括向需要其的哺乳動 物中施用體現本發明的原理的化合物或其藥用鹽。
[0015] 本發明還提供在需要其的哺乳動物中治療或預防肥胖，膜島素抗性和NA化D的方 法，其包括向所述哺乳動物施用體現本發明的原理的化合物或其藥用鹽。理想地是，所述化 合物通過僅由腸法尼醇X受體介導的但不由肝法尼醇X受體介導的信號轉導抑制腸中法尼 醇X受體并且影響肥胖，膜島素抗性和NAFLD。優選地，所述化合物具有最小的系統性生物利 用度，從而所述化合物不抑制肝法尼醇X受體，運最小化任何系統性毒性。
[0016]本發明還提供合成本發明的化合物實施方案的方法。
【附圖說明】
[0017]圖1描述了顯示牛橫-β-鼠膽酸(TMCA化培養的原代肝細胞中括抗由FXR激動劑 牛橫膽酸(TCA)導致的法尼醇X受體(FXR)激活的巧光素酶測定的結果。
[001引圖2描述了顯示牛橫-β-鼠膽酸(TMCA)在化co2細胞中括抗由FXR激動劑牛橫膽酸 (TCA)導致的FXR激活的巧光素酶測定的結果。
[0019] 圖3說明保持高脂肪膳食達8周的FxrWfi小鼠和FxrAiE小鼠的回腸粘膜中的ATP水 平。
[0020] 圖4說明由甘氨酸-β-鼠膽酸導致的對利用碟去氧膽酸的化P mRNA誘導的阻斷。
[0021] 圖5說明由甘氨酸-β-鼠膽酸導致的對利用GW4064的化P mRNA誘導的阻斷。
[0022] 圖6說明由甘氨酸-β-鼠膽酸導致的對利用GW4064的FgfigmRNA誘導的阻斷。
[002引圖7說明由甘氨酸-β-鼠膽酸導致的對由GW4064導致的A化5g mRNA抑制的倒轉。
[0024] 圖8描述了根據本發明的實施方案的化合物的合成。
[0025] 圖9描述了根據本發明的實施方案的化合物的合成。
[0026] 圖10描述了β-鼠膽酸，牛橫-β-鼠膽酸(邱MCA)，甘氨酸-β-鼠膽酸，碟去氧膽酸，牛 橫碟去氧膽酸(TCA)，和甘氨酸-碟去氧膽酸的結構。
[0027] 圖11說明在10周的高脂肪膳食后用賦形劑(vehicle)或tempol處理的FxrWfi和 FxrAiE小鼠的體重增加。
[002引圖12說明在14周的高脂肪膳食后FxrfWi和FxrAiE小鼠的W克計和作為體重的百 分數的脂肪量。
[0029] 圖13說明在7周的高脂肪膳食后對于Fxrfi/fi和FxrME小鼠的葡萄糖耐量試驗 (GTT)的結果。
[0030] 圖14說明在13周的高脂肪膳食后對于FxrfWi和FxrME小鼠的膜島素耐量試驗 (ITT)的結果。
[0031] 圖15說明在15周的高脂肪膳食后對于Fxr"/f哺Fxr&M、鼠的空腹血糖，空腹血清 膜島素，和H0M指數。
[0032] 圖16描述了在用tempol處理后喂食正常飲食的小鼠中從硬壁菌口（Firmicutes) 向擬桿菌口（Bacteroidetes)的改變。
[0033] 圖17描述了正常飲食的和用賦形劑或tempol處理的小鼠的糞便中的硬壁菌口與 擬桿菌口的比例和膽汁鹽水解酶酶活性的比較。
[0034] 圖18說明使用合成的激動劑GW4064和各種劑量的TUDCA，T ω MCA，邱MCA，TaMCA的 人FXR競爭測定。將結果相對于Reni 1 la表達標準化。
[0035] 圖19A顯示加權的化iFrac距離的主坐標分析圖。圓圈表示賦形劑-處理的小鼠中 的盲腸群落并且正方形表示tempol-治療的小鼠中的盲腸群落。兩組都喂食高脂肪飲食達 10周。
[0036] 圖19B-G顯示盲腸內容物的屬級(genus level)的16S rRNA基因測序分析。數據表 示為平均值±SD。
[0037]圖20A顯不在喂食局脂肪飲食達14周的賦形劑-和temp〇]_-治療的小鼠中的尿罔子 的主成分分析(PCA)模型的得分散點圖。
[0038] 圖20B顯示PCA模型中所有檢測的尿離子的荷載散點圖。p[l]和p[2]值表示各個離 子相對主要成分1和2的貢獻權重。具有最高荷載值的兩種離子的性質標注在圖中。在電噴 霧電離負的模式化sr)中獲得所有數據。
[0039] 圖20C顯示對甲酪硫酸醋和對甲酪葡萄糖巧酸的尿水平。將值相對于賦形劑-處理 的小鼠的那些標準化，并表達為相對豐度。
[0040] 圖20D顯示對甲酪硫酸醋（下圖）和對甲酪葡萄糖巧酸（上圖）的串聯MS和化學結 構。
[0041] 圖21A顯示在14周的高脂肪飲食處理后在賦形劑-和tempos治療的小鼠中的尿離 子的PCA模型的得分散點圖。
[0042] 圖21B顯示在14周的WD后在賦形劑-和抗生素-處理的小鼠中的尿離子的PCA模型 的荷載散點圖。P[l]和P[2]值表示各個離子相對于主要成分1和2的貢獻權重。具有最高荷 載值的兩種離子的性質注釋在圖中。所有數據在負的模式中化sr)獲得。
[0043] 圖21C顯示在14周的高脂肪飲食處理后在賦形劑-和抗生素-處理的小鼠中的對甲 酪硫酸醋和對甲酪葡萄糖巧酸的尿水平。將值相對于賦形劑-處理的小鼠的那些標準化，并 且表達為相對豐度。n = 5只小鼠/組。所有數據表示為平均值±SD。分析方差，然后雙尾 Student's t-檢驗。與賦形劑-處理的小鼠相比，沖<0.05，*沖<0.01。
[0044] 圖22A顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的賦形劑-和tempos處理的小鼠的肝切片 的代表性的H&E染色。
[0045] 圖22B顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的用賦形劑-和tempol-處理的小鼠的肝切 片的脂滴的代表性的油紅0染色。
[0046] 圖22C顯示來自喂食高脂肪飲食達16周的賦形劑-和tempos處理的小鼠的肝重。
[0047] 圖22D顯示喂食高脂肪飲食達16周的賦形劑-和tempol-處理的小鼠的肝重與體重 比率。
[0048] 圖2沈顯示來自喂食高脂肪飲食達16周的賦形劑-和tempos處理的小鼠中的肝甘 油Ξ醋(TG)含量。
[0049] 圖23A顯示來自喂食高脂肪飲食達16周的賦形劑-和tempos處理的小鼠的肝切片 的代表性的H&E染色。
[0050] 圖23B顯示來自喂食高脂肪飲食達16周的賦形劑-和tempos處理的小鼠的肝重。 [0051 ] 圖23C顯示喂食高脂肪飲食達16周的賦形劑-和tempol-處理的小鼠的肝重與體重 比率。
[0052] 圖23D顯示來自喂食高脂肪飲食達16周的賦形劑-和抗生素-處理的肝TG含量。
[0053] 圖24A顯示來自喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和抗生素-處理的小鼠的回腸 PCA 模型的得分散點圖。
[0054] 圖24B顯示喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和抗生素-處理的小鼠中的回腸離子 的PCA模型的荷載散點圖。p[l]和p[2]值表示各個離子相對于主要成分1和2的貢獻權重。具 有最高荷載值的兩種離子的性質注釋在圖中。所有數據在負的模式化sr)中獲得。
[0055] 圖25A顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的賦形劑-和抗生素-處理的小鼠的回腸中 的個體牛橫酸-綴合的膽汁酸與總膽汁酸的比例。
[0056] 圖25B顯示來自喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和tempol-處理的小鼠的回腸中 的個體牛橫酸-綴合的膽汁酸與總膽汁酸的比例。
[0057] 圖26A顯示來自喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和抗生素-處理的小鼠的糞便的 BSH酶活性。η = 4-5只小鼠/組。
[0058] 圖2她顯示喂食高脂肪飲食達12周的小鼠中的回腸 FXR表達的蛋白質印跡分析。各 個泳道表示一只小鼠。
[0059] 圖26C顯示來自喂食高脂肪飲食達12周的小鼠的回腸中的Fxr mRNA水平和FXR祀 基因化P和F奸15的mRNA水平。η = 3只小鼠/組。
[0060] 圖2抓顯示來自喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和抗生素-處理的小鼠的回腸中 的FXR祀基因化Ρ和巧η 5的mRNA水平。η = 3只小鼠/組。
[0061 ] 圖2犯顯示用賦形劑，牛橫膽酸(TCA)，和牛橫酸-β-鼠膽酸(邱MCA)與TCA處理喂食 高脂肪飲食達7周的小鼠24小時后回腸中的FXR祀基因化P和Fgfl 5的mRNA水平。η = 3只小 鼠/組。
[0062] 圖27Α顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的對照-floxed(FxrWfi)小鼠和腸-特異的 敲除小鼠(FxrAiE)小鼠的肝切片的代表性的H&E染色。
[0063] 圖27B顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的Fxr"/f哺FxrAiE小鼠的肝切片中的脂滴 的代表性的油紅0染色。
[0064] 圖27C顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的Fxr"/f哺Fxr^iE小鼠的肝重。
[0065] 圖27D顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的和FxrAiE小鼠的肝甘油S醋含 量。
[0066] 圖28A顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的Fxr"/f哺FxrAiE小鼠的回腸粘膜的線粒 體氧化憐酸化(0XP冊S)相關的酶的mRNA水平。
[0067] 圖28B顯示來自喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和抗生素-處理的小鼠的回腸粘 膜的線粒體氧化憐酸化(0XP冊S)-相關基因的mRNA水平。n = 3只小鼠/組。
[006引圖28C顯示來自喂食高脂肪飲食達12周的Fxr"/f哺FxrAiE小鼠的回腸粘膜的對于 復合物-I-和復合物-II-依賴性的呼吸測量的狀態ΠI呼吸。
[0069] 圖28D顯示喂食高脂肪飲食達7周的FxrWfi小鼠和FxrAiE小鼠的回腸粘膜中的ATP 水平。
[0070] 圖29A顯示無血清脂肪酸。對于各個脂肪酸的柱(bar),從左到右，來自賦形劑-處 理的小鼠，tempos處理的FxrWfi小鼠，賦形劑-處理的Fxr^iE小鼠和tempos處理的 Fxr^iE小鼠。
[0071] 圖29B顯示來自喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和抗生素-處理的小鼠的血清神 經酷胺。n = 3只小鼠/組。
[007^ 圖29C顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的Fxr"/f哺Fxr^iE小鼠的回腸中編碼神經 酷胺合成-和分解代謝-相關的酶的mRNA的表達。
[0073]圖29D顯示在處理喂食高脂肪飲食達14周的小鼠7周抗生素后回腸中編碼神經酷 胺合成-和分解代謝-相關的酶的mRNA的水平。
[0074]圖30A顯示源自神經酷胺的MS片段的結構并且 [00巧]圖30B-30G顯示各種神經酷胺的串聯MS和化學結構。
[0076] 圖31A顯示喂食高脂肪飲食達3天的賦形劑-和抗生素-處理的小鼠中的肝TG含量。
[0077] 圖31B顯示喂食高脂肪飲食達14周并且然后用賦形劑或抗生素處理3天的小鼠的 回腸中的Fxr，化I)和F奸15mRNA水平。
[0078] 圖31C顯示來自喂食高脂肪飲食達14周，并且然后用賦形劑或抗生素處理3天的小 鼠的回腸的神經酷胺的概況。
[0079] 圖31D顯示用賦形劑和2μΜ，5ιχΜ和lOiiM神經酷胺解育24小時后的原代肝細胞甘油 Ξ 醋(TG)含量(n = 4)。
[0080] 圖3化顯示用賦形劑和2μΜ、5ιχΜ和lOiiM神經酷胺解育16小時后原代肝細胞中的脂 肪酸合成、甘油Ξ醋合成、和脂肪酸分解代謝相關基因的mRNA水平(從左至右的柱分別針對 各個 mRNA，n = 5)。
[0081 ]圖31F顯示用賦形劑、W及和ΙΟμΜ神經酷胺解育24小時后原代肝細胞中的核 SREBP1-Ν表達的蛋白質印跡分析(η = 3)。
[0082] 圖31G顯示用賦形劑W及和1(Μ神經酷胺解育24小時后原代肝細胞中CIDEA表 達的蛋白質印跡分析(η = 3)。
[0083] 圖32Α顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的賦形劑-和抗生素-處理的小鼠的肝中編 碼脂肪酸合成和甘油Ξ醋合成相關的酶的mRNA的水平。
[0084] 圖32B顯示喂食高脂肪飲食達14周的FxrfWi和FxrAiE小鼠的肝中編碼參與脂肪酸 和甘油Ξ醋合成的酶的mRNA的表達。
[0085] 圖32C顯示來自喂食高脂肪飲食達7周的小鼠的肝中脂肪酸氧化-相關的基因的 mRNA水平。
[0086] 圖32D顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的FxrfWi小鼠和FxrAiE小鼠的肝中的脂肪 酸氧化-相關的基因的mRNA水平。
[0087] 圖32E顯示來自喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和抗生素-處理的小鼠的肝中的 SREBP1-N蛋白表達的蛋白質印跡分析。LAMIN A/C用作上樣對照(η = 3)。
[008引圖32F顯示喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和抗生素-處理的小鼠的肝中CIDEA蛋 白表達的蛋白質印跡分析。β-肌動蛋白用作上樣對照(η = 3)。
[0089] 圖32G顯示喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和抗生素-處理的小鼠的肝中的 Cyp7almRNA 水平（η = 3)。
[0090] 圖32Η顯示喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和tempol-處理的小鼠的肝中的 Cyp7almRNA 水平（n = 3)。
[0091] 圖321顯示喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和抗生素-處理的肝中的炎癥相關的 基因的mRNA水平(n = 3)。
[0092] 圖32J顯示喂食高脂肪飲食達7周的賦形劑-和tempol-處理的小鼠的肝中的炎癥 相關的基因的mRNA水平(η = 3)。
[0093] 圖33Α顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的賦形劑-和抗生素-處理的FxrfWi和Fxr AIE小鼠的肝切片的代表性的H&E染色。
[0094] 圖33B顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的賦形劑-和抗生素-處理的FxrfWi和Fxr AIE小鼠的肝切片中的脂滴的油紅ο染色。
[ΟΟΜ]圖33C顯示喂食高脂肪飲食達14周的賦形劑-和抗生素-處理的FxrfWi和FxrAiE小 鼠的肝重。
[0096] 圖33D顯示喂食高脂肪飲食達14周的賦形劑-和抗生素-處理的FxrfWi和FxrAiE小 鼠的肝重與體重比率。
[0097] 圖33E顯示喂食高脂肪飲食達14周的賦形劑和抗生素-處理的FxrfWi和FxrAiE小 鼠的肝甘油Ξ醋含量。
[0098] 圖33F顯示喂食高脂肪飲食達14周的賦形劑-和抗生素-處理的FxrfWi和FxrAiE小 鼠的回腸中神經酷胺的脂類組學概況(從左到右的柱分別針對各個神經酷胺）。
[0099] 圖33G顯示來自喂食高脂肪飲食達14周的賦