Adrb1，grk5基因多態性的檢測方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于生命科學領域，設及醫學和生物技術，具體是提供不同檢測方法(包含 但不限于改良測序方法和Taqman探針基因分型的方法）同時對β受體信號通路相關基因 ADRB1，G服5上的2個SNP位點（401^1:'31801253^及6服5:'317098707)進行快速準確的基 因分型，便于臨床對β受體阻滯劑的療效進行評估。
【背景技術】：
[0002] 屯、力衰竭（簡稱屯、衰）是一種W屯、臟累血不足而導致全身多器官灌注不足W及循 環渺血為表現的復雜臨床綜合征，合并有神經內分泌系統的異常改變，是包括高血壓、冠屯、 病、屯、肌病在內的多種屯、血管疾病的終末階段。β腎上腺素能受體(簡稱β受體)阻滯劑因能 通過阻斷過度活化的腎上腺能系統，有效降低屯、臟氧耗，改善屯、肌重構和患者長期預后，作 為標準方案用于包括屯、衰在內的多種屯、血管疾病的治療。但更多的臨床試驗和多中屯、的 me化分析報導β受體阻滯劑的總體獲益來自部分人群，即表現出個體差異性和種族差異性。
[0003] 目前，已有眾多文獻報道β腎上腺素能受體通路的基因多態性會影響β受體阻滯劑 的療效，進而潛在的影響屯、衰患者的預后。Ste地en Β丄iggett等人2006年發表的一項1040 人的歐洲屯、衰人群的研究表明m受體基因 ADRBl-Arg389Gly位多態性導致氨基酸改變影響 了布新洛爾的治療效果。與安慰劑組相比，ADRBl-Arg-389純合基因型的患者接受β受體阻 滯劑布新洛爾治療的患者死亡率下降38%(ρ = 0.03)，再住院率下降34% (ρ = 0.004)，而基 因型為ADRBl-Gly-389基因型的患者治療組和安慰劑組之間預后無統計學差異。另一項224 例屯、衰患者研究通過檢測治療后屯、功能的改善證實了 ADRB1-389位點對β受體阻滯劑治療 效果的影響，具體為:與ADRB1-G1 y-389基因型的患者相比，ADRB1 -Arg389-純合基因型的患 者治療后左室射血分數明顯改善(8.7 ± 1.1 % VS. 0.93 ± 1.7%，p<0.02) X服5是β受體下游 的G蛋白偶聯受體激酶，在其41位氨基酸的多態性G服5Gln41Leu位點在非洲人群的次要等 位基因頻率約是歐洲人群的10倍。兩項研究同時證明在不服用β受體阻滯劑的情況下GRK5- Leu41的患者的遠期生存率更高化og rank ρ = 0.013)。而G服5-Gln41基因型的患者對β受 體阻滯劑的治療反應更好，具體表現為G服5-Gln41純合基因型的患者治療后非屯、臟移植的 生存時間更長化3 = 0.22;95%(：1，0.12-0.40;口<0.001)，而〇服5-161141基因型的患者是否 接受0受體阻滯劑治療，預后無統計學差異(HR = 0.78; 95 % CI，0.35-1.17; P = 0.53)。
[0004] 從現有的研究中我們總結出β腎上腺素系統的基因多態性在屯、衰的發生中不起主 要作用，但能修飾β受體阻滯劑相關的臨床表型，包括β受體阻滯劑對短期屯、功能的改善和 長期生存率的影響，對臨床指導個體化醫療和治療效果評估有重要指導意義。但至目前為 止，根據文獻報道，針對β受體腎上腺素能系統基因多態性的檢測方法為直接測序的方法包 括傳統Sanger測序法和Pyrosequencing測序的方法。其優點為測序結果準確，但操作流程 較復雜，耗時較長，成本較高，限制了其在實際臨床工作中的發展和應用，無法滿足快速指 導臨床評估的需求，一種新的快速、準備、低成本的檢測方法成為迫切需求。
【發明內容】
：
[0005] 為彌補現有技術的不足，本發明旨在提供針對W上ADRBl-Ar的89Gly(rsl801253) 和/或G服5-Gln42Leu(rsl7098707)2個多態性位點快速準確的檢測方法，包括但不限于改 良測序和化qman探針基因分型的方法，為臨床評估屯、衰患者預后和/或β受體阻滯劑的預期 療效提供指導方案。
[0006] 為此，本發明提供W下技術方案：
[0007] 本發明提供一種屯、衰患者預后和/或β受體阻滯劑藥物治療療效評估的遺傳標志 物，其中，所述遺傳標志物是40381-4'旨389617('3 1801253)和/或6陸5-61114化611 (rsl7098707)多態性位點的基因分型。優選的，所述遺傳標志物是（l)ADRBl-Arg389Gly (rsl801253)或（2)G 服 5-Gln41Leu(rsl7098707)多態性位點的基因分型。
[000引本發明還提供一些用于檢測上述標志物的試劑。
[0009] 優選的，所述試劑包括1、針對包含上述2個SNP位點相應的目標序列的特異性擴增 引物對;和/或2、識別多態性位點的檢測探針。
[0010] 更優選的，所述針對W上2個SNP位點相應的目標序列的特異性擴增引物對的結構 如沈Q ID No. 1-4所示或者如沈Q IN No.5-6或沈Q ID No.9-10。
[00川優選的，用于擴增包含^1801253位點的目的片段的引物序列560 10齡.1-2;用 于擴增rsl7098707位點的目的片段的引物SEQ ID齡.3-4。或者用于擴增包含'31801253位 點的目的片段引物序列56010齡.5-6;用于擴增包含^17098707位點的目的片段引物序 列沈Q IN No.9-10。
[0012] 所述識別多態性位點的檢測探針為14-50個核酸的寡核巧酸序列，能特異性的與 上述多態性位點特異性雜交。進一步，所述識別探針序列由5'端的巧光報告基團，3'端的非 巧光巧滅基團W及與多態性性位點前后序列雜交的序列組成。更優選的，所述巧光報告基 團為Fam、Vi C等，3 '端的非巧光巧滅基團為MGB修飾基團。
[0013] 更優選的，所述的針對W上2個SNP位點的檢測探針結構如SEQ ID No.7-8或者SEQ ID No. 11-12所示。
[0014] 優選的，用于識別rsl801253位點等位基因 A/G的探針序列SEQIDNo.7-8;用于識 別rsl7098707位點等位基因 C/G的探針序列沈Q ID No.11-12。
[0015] 本發明還提供一種上述試劑在制備評估屯、衰患者預后和/或β受體阻滯劑藥物治 療療效的試劑盒中的用途。
[0016] 本發明還提供一種用于評估屯、衰患者預后和/或β受體阻滯劑藥物治療療效的試 劑盒，所述試劑盒包含至少一種選自上述任意一項的試劑。優選的，所述試劑盒還包括用于 檢測反應的合適的緩沖體系和檢測體系。
[0017] 優選的，所述β受體阻滯劑包括但不僅限于美托洛爾、比索洛爾、布新洛爾、卡維地 洛。
[0018] 本發明還提供檢測患者樣本中上述遺傳標志物的方法，其中，所述方法中利用上 述試劑。
[0019] 優選的，所述患者樣本選自：外周血細胞、白細胞、血清、尿樣、唾液、體液和/或(活 檢)組織樣本，優選的，所述樣品預先進行純化，例如分離總DNA。
[0020]優選的，所述方法包括（1)改良測序的方法；（2)化qman探針基因分型的方法;和/ 或(3)其他基于特異性擴增和/或識別W上多態性位點及周圍序列的方法。
[0021 ]更優選的，所述（1)改良測序的方法中，包括使用針對包含上述SNP位點相應目標 序列的特異性擴增引物。
[0022] 進一步，所述（1)改良測序的方法中，所述針對包含上述SNP位點相應的目標序列 的特異性擴增引物對結構，如SEQ ID No. 1-4。
[0023] 更優選的，所述(2)Taqman探針分型檢測方法中，包括使用針對包含上述SNP位點 相應的目標序列的特異性擴增引物和上述識別多態性位點的檢測探針對遺傳標志物進行 檢測。
[0024] 進一步，所述(2)Taqman探針基因分型檢測方法中，所述針對包含上述SNP位點相 應的目標序列的特異性擴增引物對的結構如SEQ ID No.5-6或者SEQ IN No.9-10所示。所 述識別多態性位點的探針結構如SEQ ID No.7-8或者SEQ ID No. 11-12。
[0025] 進一步，所述(3)其他基于特異性擴增和/或識別W上多態性位點及周圍序列的方 法還包括高分辨率溶解曲線的方法、液相DNA忍片分型技術、固相DNA忍片分型技術、針對包 含目的片段的PCR產物的質譜分析技術、限制性內切酶分型技術、等位基因特異性雜交技 術、寡核巧酸連接實驗等。
[00%]本發明的優點在于：
[0027] 1.本發明提供的針對ADRBlrsl801253和G服虹S17098707位點的改良測序的檢測 方法在傳統測序方法的基礎上優化引物設計，PCR擴增引物同時可作為測序引物，降低了引 物設計成本，簡化了操作。
[0028] 2.本發明提供的改良測序的方法在傳統測序方法的基礎上優化反應體系，在保證 正確正確率的前提下大大減少了測序試劑的用量，可降低到標準用量的1/16,大大降低了 檢測成本。
[0029] 3.本發明提供的改良測序的方法在傳統測序方法的基礎上優化操作流程，1天內 從樣本處理到得到檢測結果，大大簡化了操作步驟，實現了快速檢測，符合臨床試劑運用的 需要。
[0030] 4.本發明提供的化qman探針分型的方法，在引物和探針序列設計和實驗方案上做 出優化，在保證實驗結果準確性的前提下，采用半量試劑的方法，有效的節約了檢測成本， 能更好滿足臨床應用的需求。作為優選3'端的非巧光巧滅基團為MGB修飾基團，保證檢測的 特異性和成功率。
【附圖說明】
[0031] 圖1.利用改良測序的方法對ADRBlrsl801253Ar的89Gly位點進行基因分型的圖示
[0032] 圖1-上部表示ADRBlrsl801253位點對側互補連等位基因為G，患者基因型為CC型， 圖1-中部表示ADRBlrsl801253位點基因型為CG雜合型，圖1-下部表示ADRBlrsl801253位點 對側互補鏈等位基因為CC，患者基因型為GG型。
[0033] 圖2.利用改良測序的方法對G服5rs 17098707位點進行基因分型的圖示
[0034] 圖2-上部表示G服5rsl7098707位點基因型為AA型，圖2-下部表示G服5rsl7098707 位點基因型為AT型。
[0035] 圖3.利用化qman探針的方法對ADRBlrsl801253Ar的89Gly位點進行基因分型的圖 示
[0036] 右下散點代表樣品中只檢測到Fam巧光，受試者基因型為GG(右下）。左上散點表示 樣品中只檢測到Vic巧光，受試者基因型為CC(左上）。中間散點代表樣品中既檢測到化m巧 光，又檢測到Vic巧光，受試者基因型為雜合型型CG(中間）。
[0037] 圖4.利用化qman探針的方法對G服5rs 17098707位點進行基因分型的圖示
[0038] 右下散點表示樣品中只檢測到Fam巧光，受試者基因型為野生型AA(右下）。中上散 點代表樣品中既檢測到Fam巧光，又檢測到Vic巧光，受試者基因型為野生突變混合基因型 AT(中上）。
【具體實施方式】：
[0039] 下面結合具體實施例對本發明所述技術方案