一種基于代謝參數還原糖補糖生產多拉菌素工藝的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物發酵技術領域，具體涉及一種基于代謝參數還原糖補糖發酵生產 多拉菌素工藝。
【背景技術】
[0002] 多拉菌素值oramectin，DRM)，為新一代大環內醋類抗寄生蟲藥，通過基因重組的 阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis strain肥AU1069)新菌株在發酵過程中W環己焼 駿酸（cyclohexanec arbo巧lie acid, CHC)為前體而生成的一種阿維菌素類抗生素。多 拉菌素為內外兼殺劑，對線蟲、節肢動物均有良好的驅殺效果，與市售的伊維菌素類產品比 較，其抗寄生蟲范圍更廣泛、血藥濃度高峰維持時間更長、半衰期也相對較長。而且多拉菌 素在動物體內持效時間更長，是目前被認為阿維菌素族最優秀的抗寄生蟲藥物之一。
[0003] 目前多拉菌素的生產主要通過生物發酵的方法進行，主要W玉米淀粉作為其主要 的發酵碳源，但發酵周期長，單位偏低，動力成本較高，發酵成本相應增加。
[0004] 將經斜面培養和種子培養所得種子液接種至裝有發酵培養基的發酵罐，還原糖控 制是菌體產素關鍵指標，隨著發酵初期還原糖快速消耗，當培養基中的速效碳源已經不能 滿足菌體正常的生長所需，此時發酵進入代謝轉換期，還原糖濃度進一步下降，在該過程中 菌體開始逐步誘導與產素相關的酶系。
[0005] 當菌體完成了代謝轉換，進入了完全利用遲效碳源的階段時，送標志著受葡萄糖 效應的菌體酶系活力開始恢復，同時也表明菌體進入產素階段。當表征菌體活力的還原糖 濃度下降到某一數值后，既能滿足菌體次級代謝生長所需，又能最大限度產素。
[0006] 若此時在代謝轉換之后補糖過高雖然能夠大幅度提高菌濃，促進菌體的生長，但 對產素方面存在一定的抑制作用，送是由于液化玉米淀粉或麥芽糊精作為碳源被菌體快速 分解利用時產生大量的還原糖，往往對其他代謝途徑中的酶(包括抗生素合成酶和其他酶 系）有阻遏或抑制作用，即"葡萄糖效應"。
[0007] 通過檢測發酵初期的還原糖濃度，控制玉米淀粉的液化程度，既利于菌體利用速 效碳源完成初級代謝菌絲體生長，又利于菌體開始利用遲效碳源進入次級代謝；但過多遲 效碳源降解會產生大量速效碳源，不利于次級代謝產素，可通過降低初始玉米淀粉量降低 還原糖對次級代謝的影響。
[0008] 目前基于代謝參數還原糖補糖提高發酵單位生產多拉菌素工藝的方法報道并不 多。現有技術中基于代謝參數0UR補糖提高發酵單位的工藝，依賴于尾氣檢測設備，目前只 有實驗室使用，工廠一般不配套該設備，不利于推廣，不適合工業規模應用。
[0009] 該產品產素對還原糖濃度敏感，若發酵前期還原糖濃度過高或過低，會造成發酵 起步單位較低；后期還原糖濃度過高或過低，會使每天單位增長變慢，周期變長；因此，在 補糖發酵過程中，需要根據發酵過程指標確定補料的速率和用量，若反饋指標不明顯或根 據補料時間和速率與菌體產素發生沖突，將給發酵結果帶來嚴重的不利后果。
【發明內容】
[0010] 針對現有技術中存在的問題，本發明通過在菌體發酵過程中基于代謝參數還原糖 的值來進行補糖操作，提供了一種提高發酵單位生產多拉菌素工藝。
[0011] 所述的一種基于代謝參數還原糖補糖生產多拉菌素工藝，包括W下工藝步驟： (1) 、將經斜面培養和種子培養所得的種子液接種至裝有發酵培養基的發酵罐中； (2) 、發酵過程實時監測發酵罐中還原糖濃度，選擇初級代謝結束后，總糖濃度下降至 1. 5-2%wt，同時還原糖濃度降低至0. 3 wt %"!. Owt%，開始流加補糖； (3) 發酵后期單位增長緩慢，出現菌絲自溶，產品開始從胞內向胞外釋放時，放罐。
[0012] 進一步的，優選步驟（2)總糖濃度下降至1.5-2%wt，同時還原糖濃度降低至 0. 5wt%時，開始流加補糖。
[0013] 其中，步驟（2)所述斜面培養基的培養條件為：將菌株接種到斜面培養基上， 25°C~3(TC條件下，優選在27°C~29 °C條件下，培養6^8天，得到抱子；斜面培養基含有 (wt%);甘露醇1-3,黃豆餅粉1-3,瓊脂1-3,余量為蒸傭水，并將斜面培養基的pH值調節 為6. 8-7. 2,優選將斜面培養基的抑值調節為7. 0-7. 2。
[0014] 步驟（2)所述種子培養基的培養條件為；將經斜面培養所得的抱子接入種子培養 基，于25°C~30°C，優選27~29°C，搖床轉速為220~250r/min，培養40h~50h ;種子培養基含 有（wt%);玉米淀粉1-3,葡萄糖0. 3-0. 7,黃豆餅粉1-2,棉巧餅粉1-2,余量為自來水，并將 種子培養基的抑值調節為6. 8-7. 2,優選將種子培養基的抑值調節為7. 0-7. 2。
[0015] 優選，步驟（2)將種子液接入發酵罐的接種量為8-12% ((V));發酵培養條件 為；培養溫度在25~30°C，優選27-29°C，壓力0. 04-0. 06MPa，DO控制在30%-100%，轉速 200-600rpm的條件下，培養432-48化；發酵罐中發酵培養基含有（wt%);玉米淀粉10-12,黃 豆餅粉1-2,棉巧餅粉1-2,酵母粉0. 5-1，a-淀粉酶0. 01-0. 02,磯酸氨二鐘0. 2-0. 4,氯化 鋼0. 1-0. 2,硫酸鎮0. 3-0. 5,碳酸巧0. 5-0. 8,泡敵0. 1，余量為自來水，所述發酵培養基 用5%Na0H溶液調節抑6. 8-7. 2,優選將抑值調節為7. 0-7. 2。
[0016] 進一步的，優選步驟（2)發酵罐的發酵培養基先將初始玉米淀粉從12wt%降低至 8wt%，并通過控制玉米淀粉液化程度，使初始發酵還原糖濃度維持在1. 8-2wt%之間。
[0017] 所述的一種基于代謝參數還原糖補糖生產多拉菌素工藝，其特征在于，發酵后期 總糖降低至1. 5-2%，還原糖降低至0. 5%時，開始流加補糖，所述流加補糖的操作，是根據每 天消耗0. 5%的總糖標準W及每天體積揮發量，流加濃度為20%-60%液化玉米淀粉或麥芽糊 精。
[0018] 優選，本發明所述補糖為液化玉米淀粉或麥芽糊精。
[0019] 發酵后期，菌體活力下降，單位增長緩慢，出現菌絲自溶，產品開始從胞內向胞外 釋放時，表明可W放罐。
[0020] 本發明選擇在代謝轉化結束當發酵進入次級代謝期時，即完全產素期，流加補糖， 減弱了 "葡萄糖效應"，使得產品單位提高，同時降低了生產成本。本發明的技術成熟，適合 工業規模化生產。
[0021] 本發明的技術方案基于代謝參數還原糖控制，通過發酵過程實時監測還原糖濃 度，流加補糖提高發酵單位，檢測方法簡便，是實驗室及工廠都具備的常規檢測方法，適合 工業化生成，成本低。與現有技術相比，通過控制還原糖的量更直接，基于代謝參數還原糖 來控制發酵過程流加補糖的時間和速率，能顯著降低由于設備反饋指標不明顯或滯后導致 補料時間和速率與菌體產素發生沖突的概率。