基因及用途、基因元件、合成奇數(shù)中鏈脂肪醛的方法以及合成偶數(shù)中鏈脂肪烴的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及基因及用途、基因元件、合成奇數(shù)中鏈脂肪醒 的方法W及合成偶數(shù)中鏈脂肪姪的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中鏈脂肪醇因具有兩親的特性而在工業(yè)中具有非常重要的應(yīng)用，可用于表面活性 劑、醫(yī)藥、化妝品W及能源領(lǐng)域，具有1-1. 2億美元的市值。而碳鏈長度在6-16的脂肪姪類 分子是航空煤油的主要成分，具有熱值高、蒸汽壓低、凝固點(diǎn)低W及吸濕性低等優(yōu)點(diǎn)。50% 的商用脂肪醇從植物種子或者動(dòng)物脂肪中提取，剩余脂肪醇W及全部姪類都從石油中精煉 而來。無論是哪一種方法，都不能滿足現(xiàn)代社會對可持續(xù)性和環(huán)境友好的生產(chǎn)要求。相反 的，在合成生物學(xué)手段快速發(fā)展的條件下，基因工程菌株卻可W利用糖、木聚糖或者甘油等 可再生能源，特異性的合成所需產(chǎn)品。
[0003] 在工程改造的大腸桿菌中，脂肪醇和姪類物質(zhì)主要從脂肪酸合成途徑進(jìn)行衍生合 成。分別可W利用脂醜-ACP/CoA和自由脂肪酸Η種分子作為合成前體物。在姪醇的合成 中，將脂醜-ACP/CoA或脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪醒是一個(gè)關(guān)鍵性步驟，隨后脂肪醒再被還原為 脂肪醇或經(jīng)脫撰基反應(yīng)成為少一分子碳的姪類物質(zhì)。W脂醜ACP/CoA為前體物的脂肪醇 /姪類物質(zhì)的微生物合成自2010年起出現(xiàn)報(bào)到。而W自由脂肪酸為底物合成中鏈姪醇類 物質(zhì)的人工合成體系直到2013年才出現(xiàn)兩篇報(bào)道?；痺ard等人在大腸桿菌中過表達(dá)來 自香棒樹（Cinnamomum camphora)中的硫醋酶，將特定長度的自由脂肪酸從脂醜-ACP中 釋放出來，并同時(shí)表達(dá)發(fā)光桿菌（Photorh油dus luminescens)的luxC, lu址，luxE基因 編碼的脂肪酸還原酶（fatty acid reductase, FAR)和來自念珠藻（Nostoc punctiforme PCC73102)中的脂肪醒脫撰基酶，將自由脂肪酸還原成脂肪醒并脫駿成減一個(gè)碳原子的姪 類分子，構(gòu)建了能夠合成長度相對可控的W自由脂肪酸為底物的姪類合成系統(tǒng)。A化tar等 人發(fā)現(xiàn)來自海魚分枝桿菌（Mycobacterium marinum)中的駿酸還原酶（carbo巧lie acid re化ctase，CAR)能夠?qū)㈡滈L范圍從C6到C18的自由脂肪酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的脂肪醒。將送個(gè) 酶與脂肪醒還原酶或者脂肪醒脫駿酶結(jié)合，可W在體外構(gòu)建生產(chǎn)偶數(shù)鏈長（C8-C16)的脂 肪醇和奇數(shù)鏈長（C7-C15)的姪類化合物。當(dāng)在胞內(nèi)將該路徑與能產(chǎn)生特定鏈長自由脂肪 酸的硫醋酶相結(jié)合后，E. coli BL2UDE3)菌株在W葡萄糖為碳源的最小培養(yǎng)基中能夠合成 出產(chǎn)量高達(dá)350mg/L的脂肪醇。
[0004] W上兩種W自由脂肪酸為底物的姪類合成系統(tǒng)因都采用還原酶進(jìn)行成醒反應(yīng)，故 稱之為還原型姪類合成系統(tǒng)。因?yàn)樵谙嗤牡孜飾l件下，還原酶需要細(xì)胞為其提供還原力 (NAD(巧H)和能量（AT巧才能發(fā)生反應(yīng)，而氧化酶則是由氧分子來提供反應(yīng)動(dòng)力，因此氧化 型合成體系是更為經(jīng)濟(jì)的微生物合成體系。目前還沒有氧化型姪類人工合成構(gòu)建的相關(guān)工 作被發(fā)表出來。
[0005] 另外一方面，在現(xiàn)有報(bào)道的工作中，無論是W脂醜-ACP/CoA還是W自由脂肪酸為 前體物的姪醇人工合成體系，因?yàn)榈谝徊降倪€原反應(yīng)均不涉及脫碳反應(yīng)，因此所合成的脂 肪醇均為偶數(shù)碳鏈，而姪類分子因?yàn)橐徊矫撟磻?yīng)而均為奇數(shù)碳鏈。實(shí)際上，石油基的化 學(xué)品和燃料結(jié)構(gòu)都具有多樣性，同時(shí)包含直鏈和支鏈、奇數(shù)鏈和偶數(shù)鏈的分子，一個(gè)理想的 生物燃料應(yīng)該是在結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性上都與現(xiàn)行的石油基燃料相類似。曾有工作通過改變上 游脂肪酸合成路徑用于下游合成支鏈和偶數(shù)鏈焼姪。但還沒有任何工作直接調(diào)控下游合成 路徑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 有鑒于此，本發(fā)明提供基因及用途、基因元件、合成奇數(shù)中鏈脂肪醒的方法W及合 成偶數(shù)中鏈脂肪姪的方法。α-加雙氧酶將前體物脂肪酸分子轉(zhuǎn)化為重要中間代謝物一 脂肪醒的過程為氧化反應(yīng)，不需要細(xì)胞提供額外的還原力和能量，降低了細(xì)胞生產(chǎn)的負(fù)擔(dān)； 填補(bǔ)了脂肪醇產(chǎn)物鏈長僅為偶數(shù)，脂肪姪產(chǎn)物鏈長大多為奇數(shù)的技術(shù)局限，可W使生物基 大宗化學(xué)品W及生物燃料的分子與石油基相關(guān)產(chǎn)品更為匹配。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種基因，其具有：
[000引 （I )如SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列；或
[0010] ( II )女口 SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列的互補(bǔ)序列；或
[0011] (III)與（I )或（II )的核巧酸序列編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性而 與（I )或（II )的核巧酸序列不同的序列；或
[0012] (IV )與（I )或（II )或（III)所述序列至少有80%同源性的序列。
[0013] 本發(fā)明還提供了上述基因用于合成脂肪醒、奇數(shù)中鏈脂肪酸、偶數(shù)中鏈脂肪姪的 用途。
[0014] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述脂肪醒為奇數(shù)中鏈脂肪醒。本發(fā)明所述中鏈脂肪 酸、中鏈脂肪醇、中鏈脂肪姪分別表示含有含有8-14個(gè)碳原子的脂肪酸、脂肪醇和脂肪姪 分子。
[0015] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述脂肪醒為奇數(shù)中鏈脂肪醒。
[0016] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述脂肪醒為1-十一醒、十Η醒或十五帰醒。
[0017] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述奇數(shù)中鏈脂肪酸為1-^ 醇、1-十Η醇或1-十五 醇。
[001引在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述偶數(shù)中鏈脂肪姪為鏈長為C12和C14的脂肪姪。
[0019] 本發(fā)明還提供了 一種含有上述基因的載體。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種含有上述載體的宿主細(xì)胞。
[0021] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種用于脂肪醒的基因元件，其含有上述的基因。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種用于合成奇數(shù)中鏈脂肪醒的基因元件的構(gòu)建的方法，包括如 下內(nèi)容：
[0024] 1)將大腸桿菌內(nèi)源硫醋酶基因（tesA')連接到pTr地is2A載體中，形成 pHisTrc-tesA 質(zhì)粒；
[002引 2)將含有Ph。啟動(dòng)子的硫醋酶序列連接到pACYCDuet-1質(zhì)粒中，形成 pACYC-Trc-tesA 質(zhì)粒；
[002引扣將569 ID N0:11所示的α-加雙氧酶基因（α-dox)連接到祀T21a質(zhì)粒中，形 成祀T21a-Dox質(zhì)粒。
[0027] 本發(fā)明還提供了一種用于合成奇數(shù)中鏈脂肪醇的基因元件，其含有上述的基因和 醒基還原酶基因。
[0028] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述醒基還原酶基因選自具有如SEQ ID No. 2所示的 核巧酸序列的基因、a化P、yj濁、y化D或a化E。
[0029] -種用于合成奇數(shù)中鏈脂肪醇的基因元件的構(gòu)建的方法，其特征是；將不同類型 或來源的醒基脫氨酶基因（曰化？、7北8、7化0、3化6和569 10^:2所示的3山1192)連接 到祀T28a 質(zhì)粒中，形成 28a-A化P、28a-Yj濁、pET28a-YcihD、祀T28a-A化E、祀T28a-Slrll92 質(zhì)粒。
[0030] 本發(fā)明還提供了一種用于合成偶數(shù)中鏈脂肪姪的基因元件，其含有上的基因和撰 基脫撰酶基因。
[0031] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述撰基脫撰酶基因選自具有如SEQ ID No. 3、4或5 所示的核巧酸序列的基因或ad73102。
[0032] 本發(fā)明還提供了一種用于合成偶數(shù)中鏈脂肪姪的基因元件的構(gòu)建的方法將 不同類型或來源的醒基脫撰酶基因 （SEQ ID N0:3所示的cerUSEQ ID N0:4所示的 a貼313、沈Q ID N0:5所示的ad7942、ad73102)連接到祀T28a質(zhì)粒中，形成祀T28a-CER1, 祀T28a-AD9313, pET28a-AD7942 和祀T28a-AD73102 質(zhì)粒。
[0033] 本發(fā)明提供了一種合成奇數(shù)中鏈脂肪醒的方法，包括如下步驟：
[0034] 步驟1 ;將上述的基因連接到載體中，構(gòu)建表達(dá)載體；
[0035] 步驟2 ;將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，表達(dá)，收集表達(dá)產(chǎn)物，即得。
[0036] 具體的，包括如下步驟：
[0037] 1)將α -加雙氧酶基因從祀T21a-Dox質(zhì)粒中帶RBS的dox基因連接到 pACYC-Trc-tesA質(zhì)粒中，形成CYX134質(zhì)粒
[003引。將〔￥乂134質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入E. coli化21觸扣菌株中，發(fā)酵，收集產(chǎn)物，即得。
[0039] 本發(fā)明還提供了一種合成奇數(shù)中鏈脂肪醇的方法，包括如下步驟：
[0040] 步驟1 ;構(gòu)建含有硫醋酶基因及所述硫醋酶基因啟動(dòng)子的第一載體；
[0041] 步驟2 ;將上述的基因經(jīng)酶切連接到所述第一載體，構(gòu)建第二載體；
[0042] 步驟3 ;將醒基還原酶基因經(jīng)酶切連接到所述第二載體，構(gòu)建表達(dá)載體；
[0043] 步驟4 ;取所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，表達(dá)，收集表達(dá)產(chǎn)物，即得。
[0044] 具體的，包括如下步驟：
[0045] 1)將不同來源的醒基還原酶基因從28a-A化P、28a-Yj濁、pET28a-YqhD、 祀T28a-A化E、祀T28a-Slrll92的質(zhì)粒中用甜al和BamHI酶切后分別連接到用Spel和 BamHI 酶切的 CYX134 質(zhì)粒中，形成 CYX143、CYX144、CYX14