賦予植物黃萎病抗性的lrk2基因及其應用
【專利說明】賦予植物黃萎病抗性的LRK2基因及其應用 -、技術領域
[0001] 本發明提供了一個賦予植物黃萎病抗性的L服2基因及應用，屬于植物基因工程領 域。用于通過植物基因工程技術改善植物抗病性和其他有益生產性狀。 二、【背景技術】
[0002] 目前，生產上黃萎病危害十分嚴重，是棉花、番茄、辣椒、茄子等植物的主要真菌病 害，造成減產甚至絕收，尚無有效的防治措施。黃萎病的病原主要為大麗輪枝菌 (Ve;rticillium dahliae)，W微菌核(microsclerotia)形式長期存在于±壤中。黃萎病菌 在寄主植物上會表現出致病性差異，在與寄主相互作用、協同進化及生態環境差異的影響 下，常產生生理分化，出現新的致病類型。張天真等用RAP時旨紋圖譜聚類分析將我國棉花黃 萎病菌株劃分為8類，但是同一類中可能同時含有強中弱致病菌，說明黃萎病致病機制十分 復雜(張天真，2000)。另外，由轉座子和DNA水平轉移等引起黃萎病菌的遺傳變異也限制了 棉花抗黃萎病育種(Amyotte SG，et al.,2012;de Jonge,et日1.,2012)。因此，克隆抗性基 因、解析抗病機制對抗黃萎病育種意義重大而迫切。
[0003] 然而，目前對黃萎病具有抗性的基因較少，尤其對棉花黃萎病具有穩定廣譜高抗 的基因未見報道。Fradin等（2011)將番茄中Vel轉化擬南芥，獲得了對黃萎病菌的抗性，而 該基因轉化煙草和棉花后，不具有黃萎病抗性，表明該基因在植物上的應用具有物種特異 性巧IJ琳琳等，棉花與番茄抗棉花黃萎病不依賴于Vel，中國科學:生命科學，2014(44)卷第8 期：803-814)。從抗黃萎病海島棉品種H7124中克隆了與番茄Vel基因 （Fradin et al.， 2009)和棉花加 Ve基因 （Zhang et al. ,2011)部分同源的化vel基因，該基因也具有典型的 植物抗病蛋白結構域，利用VIGS沉默加 ve 1基因可使海島棉H7124對黃萎病的抗性喪失;并 且，Gbvel基因轉化擬南芥和陸地棉的結果都表明化vel基因對強致病力的落葉型和非落葉 型黃萎病菌都具有抗性(Zhang et al.，2012a)，但是并未獲得高抗黃萎病品種。除了Ve基 因外，一些下游防衛相關基因也用于抗黃萎病防治研究。過量表達AtNPRl基因的轉基因棉 花對非落葉型黃萎病具有抗性，但是對落葉型黃萎病不具有抗性(Par化i et al.2010)。另 夕h水稻黃單胞菌harpin蛋白、幾下質酶基因、脂質轉移酶基因、天麻抗真菌蛋白、抗菌膚、 防御素（目-DefensinsKMiao et al.，2010;Munis，2010;Ni Μ et al.，2013)也對黃萎病表 現出一定的抗性，但是由于防衛基因的過量表達對植物生長發育帶來一些不利影響、W及 抗性效果未達到預期目標等，從而限制了運些基因在生產上的應用。
[0004] 本研究通過陸地棉高抗黃萎病品種奧3503的轉錄組進行分析，發現一個受黃萎病 侵染誘導表達的基因 LRK2，該基因與雷蒙德氏棉LYK2-Like基因 （Gossypium raimondii protein LYK2-like，登錄號XM_012602491)相似度98%，W該基因的序列為模板設計引物 將L服2基因克隆，并將該基因轉化擬南芥，獲得的轉基因擬南芥植株對落葉型W及非落葉 型菌系均具有較高的抗性。棉花黃萎病抗性基因 LRK2的分離可W進一步豐富抗性基因資 源，對其功能研究為該類基因的進一步利用奠定基礎。 Ξ、
【發明內容】
[000引技術問題
[0006] 本發明的目的是:提供了一個賦予植物黃萎病抗性L服2基因的應用，該基因編碼 一個表面受體蛋白，受黃萎病病原菌誘導后表達量顯著增加。該基因表達可W顯著提高受 體植物對落葉黃萎病病原菌V991W及非落葉型黃萎病菌ΒΡ2的抗性。可W利用本發明基因 構建成各種植物表達載體，應用于農業生物技術育種W提高作物抗病性狀。
[0007] 技術方案
[000引賦予植物黃萎病抗性的L服2基因，其序列為SEQ ID NO. 1。該基因來源于陸地棉品 種奧3503"LRK2基因完整編碼框長度為2016個堿基，編碼蛋白含671個氨基酸，分子量為 74邸，等電點為7.85。
[0009] 本發明還提供了含有本發明基因的表達載體和宿主菌W及擴增該基因的任一片 段的引物。
[0010] 本發明賦予植物黃萎病抗性的L服2基因，該基因受棉花黃萎病強致病力菌株V991 (徐榮旗，汪佳妮，陳捷胤等.棉花黃萎病菌T-DNA插入突變體表型特征和側翼序列分析.中 國農業科學，2010，43(3):489-496)的誘導后表達量增加，將L服2與pCambia2301 (上海北諾 生物科技有限公司）載體構建植物表達載體轉化擬南芥，結果該基因對棉花黃萎病強致病 力落葉型菌株V991W及強致病力非落葉型菌株BP2均具有較高抗性。可W利用本發明基因 構建成各種植物表達載體，應用于農業生物技術育種W提高黃萎病相關寄主植物的抗病性 狀或用在棉花黃萎病抗性改良中。
[0011] L服2的功能研究可為掲示其表達調控機理W及具體功能打下基礎，還可應用于植 物抗病基因工程W及抗逆性的基因工程改良中。
[0012] 所述LRK2基因在擬南芥植物黃萎病抗性中的的應用。包括：
[0013] 1 )LRK2基因的克隆W及植物表達載體的構建
[0014] W陸地棉品種奧3503的cDNA為模板，用引物
[0015] P1:5 '-TGCTCTAGAATGGCATCTGTAATGAGTAA-3 '，
[0016] P2:5 '-CGCGGATCCTCACAGATTGGATGTTGTG-3 '
[0017] 擴增得到2016bp片段，將該片段命名為LRK2，PCR產物純化后用Xbal/BamHI酶切， 連接到pCambia2301載體，測序后成功構建的重組載體命名為pCambia2301: L服2; 2)轉基因 植株的獲得
[0018] 將步驟1)中構建好的pCambia2301:L服2質粒用凍融法轉化農桿菌LBA4404,用薩 花法轉化擬南芥，當代的擬南芥植株為TO代，收獲的種子為T1代，T1代種子在含25mg/mL卡 那抗生素的1/2MS培養基上篩選，獲得候選的陽性T1植株，分別在DNA和RNA水平上檢測目的 基因是否轉入W及是否成功表達：
[0019]用引物
[0020] P3:5 '-CAGGATCTCAGAATGCCGGA-3 '
[0021 ] P4:5 ' -TGCCCTTMTTCATCTGCGC-3 '
[0022] 擴增候選的陽性T1代植株的DNA和cDNA進行PCR鑒定，在DNA和cDNA水平均能擴增 獲得821bp大小片段的T1植株則為成功轉化L服1的陽性轉基因植株。收獲的種子為T2代。T2 代陽性轉基因植株在含25mg/mL卡那抗生素的1/2MS培養基上生長，且具有黃萎病抗性。
[0023] 有益效果
[0024] 1.本發明獲得了一個全新的賦予植物黃萎病抗性的L服2基因。本發明獲得的L服2 基因來源于陸地棉品種奧3503,該基因受棉花黃萎病病原菌誘導后表達量明顯上升。將 LRK2與構建植物表達載體轉化擬南芥，結果該基因在轉基因植株中表達后對落葉型強致病 力黃萎病菌V991和非落葉型強致病力黃萎病菌BP2均具有較強的抗性，平均發病率分別為 18.95%、16.6%，而對照野生型的發病率分別為61.20%、55.70% dL服2的分離可W進一步 豐富抗性基因資源，其功能研究為該類基因的進一步利用奠定基礎。
[002引2.本發明有助于更好地了解抗病基因的作用機制。L服2的克隆為進一步了解病原 菌與抗病基因互作，抗病信號傳導通路奠定基礎。LRK2是怎樣將抗性信號傳導的，此基因參 與了哪些信號傳導過程，可W利用該基因的轉基因植株進行進一步分析，從而獲得抗性信 號傳導通路。LRK2的分離W及功能鑒定為研究抗病基因的作用機制奠定基礎。
[0026] 3.本發明應用于黃萎病抗性育種。L服2抗性效果良好，對測試的落葉型黃萎病菌 系V991和非落葉型黃萎病菌系BP2,發病率均低于20%，而對照的發病率在50% W上，大幅 提高了對黃萎病的抗性，在育種中有較大的應用價值。 四、
【附圖說明】
[0027] 圖1落葉型黃萎病菌系V991和非落葉型菌系BP2處理陸地棉品種奧3503后LRK2的 表達。
[002引圖2 L服2轉基因植株的DNA水平分子檢測。M，MarkerDWT為未轉化植株;L服2為卡 那霉素篩選出的抗性轉化株。
[0029] 圖3 L服2轉基因植株的RNA水平檢巧UdWT為未轉化植株;L服2為卡那霉素篩選出的 抗性轉化株。上排WcDNA為模板，L服2引物擴增，下排是內參Actin引物擴增。
[0030] 圖4落葉型黃萎病菌系V991和非落葉型菌系BP2接種L服2轉化植株和對照株的發 病率調查。WT為未轉化植株，LRK2為轉化株。
[0031] 圖5落葉型黃萎病菌系V991和非落葉型菌系BP2接種L服2轉化植株和對照株的表 型。WT為未轉化植株，LRK2為轉化株。
[0032] 圖6落葉型黃萎病菌系V991和非落葉型菌系BP2接種L服2轉化植株和對照株的相 對菌絲含量。WT為未轉化植株，LRK2為轉化株。 五、
【具體實施方式】
[0033] 下述實施方式中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物序列均由上海英 驗生物技術有限公司合成。本實驗中基因來源于陸地棉品種奧3503(Gossypium hirsutum) (劉小雙，劉廷利，袁洪波，張保龍，王榮富.棉花鋼尿膚基因化PNPl的耐旱功能分析.中國農 業科學，2015,48(12): 2306-2316)。
[0034] (一)棉花LRK2克隆W及序列分析
[003引根據雷蒙德氏棉LYK2-L;Lke基因 （Gossypium raimondii ,protein LYK2-like，登 錄號XM_012602491)設計引物
[0036] P1:5'-TGCTCTAGAATGGCATCTGTAATGAGTAA-3'，
[0037] P2:5 '-CGCGGATCCTCACAGATTGGATGTTGTG-3 '
[003引 w陸地棉品種奧3503的cDNA模板擴增，在25μ1反應體系中加入cDNA模板化1，引物 各5nmol，扣 1 SXprimeSTAR buffer(Mg2+plus)PCR緩沖液，0.2mM dNTP，lU primeSTAR HS DM Polymerase(TaKaRa公司）進行PCR擴增。PCR擴增條件為：94°C 3'后94°C 45"，56°C 45"，72°C 2/，循環36次，再72°C延伸l0/ dPCR產物在1%的瓊脂糖凝膠上檢測，得到片段為 2016bp，將該片段命名為L服2基因，其序列為SEQ ID N0.1。將該片段進行末端加 A處理(北 京天恩澤基因科技有限公司）并與pGEM-T easy載體(Promega公司）連接。連接產物用JM109 (北京全式金生物技術有限公司)感受態細胞進行熱激轉化。測序由上海英驗生物工程公司 完成，成功構建的質粒命名為pGEM-T easy:LRK2。用DNA club進行基因開放閱讀框的確定， 用DNAMAN進行序列比較分析，同時利用網上數據庫化ttp://www.ncbi .nlm.nih. gov/)進行 BLAST分析。數據庫ExPASy化ttp: //cn. expasy. org/)進行