一種人源溶菌酶蛋白純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于蛋白純化領域，具體而言，本發明涉及一種純化人源溶菌酶蛋白的方 法。本發明還涉及該生產方法的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著生物技術的發展，獲得蛋白的方法越來越多，經典的蛋白質分離純化過程通 常包括W下步驟；（1)破碎生物組織，用適當的緩沖液將蛋白質抽提出來；(2)用離必法將 細胞的亞細胞顆粒（如細胞核、線粒體、微粒體或核糖體等及細胞碎片去除；（3)應用鹽析 法或有機溶劑法將有關蛋白質組分沉淀下來；(4)進一步應用層析法或電泳使各種蛋白質 分開；（5)如果用可能的話，將蛋白質結晶或制成凍干粉。
[0003] 用該方法獲得人源蛋白需考慮W下問題；第一，人組織來源少，而目的蛋白含量 高、活性高可溶性穩定性好的組織來源就更少了；第二，每個分離純化的步驟都會損失一定 量的蛋白及蛋白活性，但是分離步驟太少又不能達到一定的純度；第H，每個分離純化的步 驟中所用的試劑及相關參數對不同的蛋白的適用范圍都是不同的；第四，不同蛋白的精確 定性定量通常需要特定的方法。
[0004] 隨著生物化學的發展，膚的人工合成已成為可能，然而送種方法只適合于合成含 有十幾個氨基酸殘基的小蛋白，況且化學儀器中合成的蛋白是否與天然存在的蛋白具有一 致的構象與功能還有待于進一步研究。
[0005] 目前，運用基因工程技術也可W在大腸桿菌、酵母、昆蟲和哺乳動物等多種表達體 系中高效表達，但是送種生產蛋白的方法同樣涉及到分離純化的問題。
[0006] 溶菌酶是分解粘多糖的多膚類免疫抗菌分子。它具有耐熱、耐酸的理化特性，可溶 于水、己醇、油脂類溶劑，通過裂解細胞壁而達到裂解革蘭氏陽性細菌的效果。對溶菌酶殺 菌能力研究表明：極微量的溶菌酶即可殺滅溶壁微球菌、藤黃球菌、巨大芽抱桿菌、棒狀桿 菌、乳酸桿菌、細球菌、八迭球菌、葡萄球菌等自然界常見細菌。目前市場上的溶菌酶都是來 源于其他種屬動物機體，對人體而言是異體蛋白，有很強的抗原性，副作用大。
[0007] 天然人溶菌酶主要存在于人乳汁、唾液、眼淚、胎盤等分泌物和器官中，由于來源 受限且不易提取，所W價格昂貴。目前，科研人員已利用化學合成法或從人類細胞組織中制 備cDNA等途徑獲得人溶菌酶基因，一些已經在真菌、細菌、動物反應器等體系中得到表達， 但是產量非常有限，不能滿足其在食品、醫藥、畜牧等行業的廣泛應用。
[0008] 目前，分離純化工藝的建立一般都經過實驗室研究、中間試驗生產到工業規模生 產線的放大過程。畢赤酵母在表達重組人溶菌酶的過程中會產生色素物質，使發酵液呈黃 綠色，同時還會產生雜蛋白、核酸等雜質，因此需要對發酵液進行純化處理，才能用于后續 研究。目前關于溶菌酶的分離純化方法，主要有結晶法、離子交換法和親和色譜法。結晶法 是最傳統的制備溶菌酶的方法，主要是根據溶液條件，使溶菌酶W結晶態析出，該方法操作 簡便，成本很低，但是產率偏低，很難獲得高純度產品；W親和為基礎的分離技術存在處理 量比較小，親和介質價格昂貴的弊端；離子交換法是最常用的提純方法，該方法是利用溶液 中各種帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異從而分離出目的蛋白，簡便、高效、可自動 化連續操作，但現存的問題是，發酵液為無機鹽培養基，離子濃度很高，上樣前需對發酵液 進行稀釋W降低離子強度，否則色譜柱填料剛性小，及易被堵塞，造成再生使用的麻煩，造 成了分離速度和效率低下。
【發明內容】
[0009] 本發明要解決的技術問題是提供一種操作簡便、成本低廉、產品純度高的人溶菌 酶純化方法，W達到工藝周期短、收率高，易于線性放大至生產規模的目的。
[0010] 為了解決上述技術問題，本發明建立了復合型陽離子交換介質分離純化發酵液中 人源溶菌酶的新工藝；發酵液經離必、過濾處理后無需稀釋可直接上柱純化，經一步純化目 的蛋白即達到電泳純。首先采用復合型陽離子交換柱Bestarose MMC Diamond捕獲蛋白，然 后用凝膠過濾柱Bestdex G-25進行緩沖液置換，最后用陽離子交換柱SP Bestarose FF濃 縮目的蛋白，最終蛋白濃度可達27mg/mL ;每一步收率分別為92. 67%、91. 9%和94. 68%， 總蛋白收率為80. 63%，純化倍數約15倍；HPLC檢測終產品為單一峰，純度大于99%。
[0011] 本發明的人源溶菌酶蛋白純化方法包括W下步驟：
[001引發酵液的前處理；
[0013] Bestarose MMC Diamond 捕獲；
[0014] Bestdex G-25 緩沖液置換；
[001引濃縮目的蛋白。
[0016] 發酵液的前處理主要包括去除含有人溶菌酶溶液中的固體雜質、調整酸堿度等。
[0017] 本發明中，將含有人溶菌酶溶液的抑調至中性偏酸，與后續層析柱緩沖液的抑值 相匹配。同時，利用濾膜去除溶液中的小顆粒雜質。
[0018] 去除雜質時，可W先將溶液離必，收集上清，然后使用中空纖維超濾膜處理上清 液，進一步除去樣品中的小顆粒物質。
[0019] 調節抑值時，將含重組人源溶菌酶的發酵液調抑至6. 5,然后12000巧m，離必 15min，收集上清液。然后，加入 Bestarose MMC Diamond 緩沖液 B(1.5M 化Cl，20mM ΡΒ,ρΗ 6. 5)調節樣品電導使其與緩沖液Α(0.4Μ化Cl，20mM ΡΒ,ρΗ 6. 5)電導一致（約43ms/cm)， 即為Bestarose MMC Diamond柱上樣原樣。
[0020] 本發明中，含有人溶菌酶溶液可W直接采用人溶菌酶溶液的發酵液。
[0021] Bestarose MMC Diamond捕獲需要根據目標產品的理化性質，選擇合適的色譜條 件。
[002引人源溶菌酶為堿性蛋白，等電點較高（pi W 10)，其最適抑^6.5,室溫下在中性 鹽溶液中有較高的天然活性。故純化過程中選擇緩沖液的抑接近中性，W避免樣品在分離 純化過程中發生變性。而在抑中性條件下人源溶菌酶帶正電荷，因此傳統工藝中一般選用 陽離子交換介質（如SP、CM)作為人溶菌酶的純化介質。
[0023] 平衡緩沖液平衡5個柱體積，至層析柱流出液的抑、電導與平衡緩沖液一致，將上 述處理后樣品W 30mL/min流速上樣，上樣結束后用平衡緩沖液清洗3~5個柱體積直到基 線穩定，即所有未結合的物質都被沖洗出分離柱。然后用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，根據 UV280洗脫峰收集樣品。
[0024] 本發明的一個實施例中，采用的層析柱和緩沖液的條件如下：
[00巧]層析柱；BXK 50/30, Vt = 300血。
[0026] 平衡緩沖液 A ;0. 4M 化C1，20mM PB，抑 6. 5。
[0027] 洗脫緩沖液 B ;1. 5M 化C1，20mM PB，抑 6. 5。
[0028] 由于Bestarose MMC Diamond柱的洗脫樣品體積較大，蛋白質濃度較低，需要對樣 品進行濃縮才能達到要求。
[0029] 本發明使用SP Bestarose FF柱進行樣品濃縮，故在濃縮之前需對樣品進行緩沖 液置換，使其電導小于l〇ms/cm(Besta;rose MMC Diamond柱洗脫樣品電導約為135ms/cm)。
[0030] 本發明的一個實施例中，Bestdex G-25緩沖液置換時采用的層析柱和緩沖液的條 件如下：
[0031] 層析柱；BXK 200/500, Vt =化。
[003引 平衡緩沖液；20mM NaAC (醋酸鋼，CHsCOONa)，抑4. 75。
[0033] 平衡緩沖液平衡2個柱體積，至層析柱流出液的pH、電導與平衡緩沖液一致，將 Bestarose MMC Diamond洗脫樣品W 200血/min流速上樣，上樣體積應小于1.化。上樣結 束后繼續用平衡緩沖液清洗，根據UV280峰收集樣品。
[0034] 本發明采用SP Bestarose FF濃縮目的蛋白。
[0035] 平衡緩沖液平衡3~5個柱體積，至層析柱流出液的抑、電導與平衡緩沖液一致， 將置換過緩沖液的樣品W 20mL/min流速上樣，上樣結束后用平衡緩沖液清洗3~5個柱體 積直到基線穩定，即所有未結合的物質都被沖洗出分離柱。然后用洗脫緩沖液洗脫目的蛋 白，根據UV280洗脫峰收集樣品。
[0036] 本發明的一個優選例中，采用SP Bestarose FF濃縮目的蛋白的層析柱和緩沖液 的條件如下：
[0037] 層析柱；BXK 50/30, Vt = 280ml。
[0038] 平衡緩沖液；20mM NaAC，抑 4. 75。
[0039] 洗脫緩沖液；0. 15M化C1，20mM PB (磯酸鹽緩沖液），抑7. 5。
[0040] 本發明的創新如下：
[0041] 1.建立了復合型陽離子交換介質分離純化發酵液中人源溶菌酶的新工藝：發酵 液經離必、過濾處理后無需稀釋可直接上柱純化，經一步純化目的蛋白即達到電泳純。首先 采用復合型陽離子交換柱Bestarose MMC Diamond捕獲蛋白，然后用凝膠過濾柱Bestdex G-化進行緩沖液置換，最后用陽離子交換柱SP Bestarose FF濃縮目的蛋白，最終蛋白濃度 可達27mg/mL ;每一步收率分別為92. 67%、91. 9%和94. 68%，總蛋白收率為80. 63%，純化 倍數約15倍；HPLC檢測終產品為單一峰，純度大于99%。
[0042] 2.酶學性質研究發現該酶米氏常數Km為0. 0233g/mU最適抑為6. 0,在偏酸性 條件下（pH = 5. 8~6. 4)穩定性較好，37°C賠育比后仍保持80% W上的活力；最適溫度 45°C，在不同溫度下耐熱性有所不同，3(TC~6(TC賠育比后，酶活下降20 %，7(TC賠育比 后，酶活下降70%，但在9(TC高溫賠育比后，酶活仍有60%。不同的金屬離子和添加劑對 酶活的影響是；rfe\Mn2+Je2\Mg2\r和Ca2+離子不同程度地促進的活性；Zn 2\Ba2\ 化2\ Co2+抑制的活性，除了邸ΤΑ添加劑能夠促進活性外，其余添加劑均對其抑制。
[0043] 3.采用牛津杯法檢測h-LYZ對九株供試菌的抑菌作用，同時用微量肉湯稀釋法檢 測