一種分離純化肝臟枯否細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分離純化細胞的方法，尤其涉及一種分離純化肝臟枯否細胞的方法，屬于醫學技術領域。
【背景技術】
[0002]肝臟的免疫應答反應與肝癌、肝炎病毒感染和慢性肝病肝損傷等多種肝臟疾病相關，已經得到越來越多的關注和研究。巨噬細胞是人體重要的免疫細胞，且肝內的枯否細胞對于肝臟本身和全身的免疫應答都極為重要。肝臟枯否細胞約占肝臟總細胞的15%，全身巨噬細胞的50%，主要位于肝竇壁，是腸源性病原體在肝內首先接觸的細胞，是肝內重要的固有免疫細胞之一，參與固有免疫反應，還能通過分泌促炎因子和趨化因子，影響其他免疫細胞，如T細胞、中性粒細胞等的活化和肝內的聚集，參與影響固有免疫和先天免疫的交互影響，產生進一步的免疫應答。對枯否細胞的進一步深入的研究，首先必須建立一種高效的細胞分離純化方法。1977年首次通過實驗分離出鼠類肝臟枯否細胞，上世紀90年代通過密度梯度離心獲得了較高純度和活性的鼠肝臟枯否細胞，本世紀初Valatas等人又根據枯否細胞貼壁的特性，對分離純化方法作了進一步改進，通過肝臟組織消化處理、密度梯度離心、密度梯度離心和貼壁選擇四步法，使枯否細胞純度達95 %左右，細胞得率達80-100 X16個/肝。但是，密度梯度法設備昂貴復雜，在未具備條件的實驗室難以開展，耗時長，且無法得到所需特定表型的枯否細胞。綜上所述，機械灌注和密度梯度離心法，雖然可以獲得較高純度和活性的枯否細胞，但存在以下缺點:一，密度梯度離心法設備較為昂貴，一些實驗室不能夠滿足實驗條件;二，分選時間較長，對細胞活性及后續實驗可能存在影響;三，操作較為復雜，技術掌握較為困難。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是針對現有技術存在的缺陷，提出一種分離純化肝臟枯否細胞的方法，滿足實驗條件，操作簡單，耗時短的同時獲得高純度的肝臟枯否細胞。
[0004]本發明通過以下技術方案解決技術問題:一種分離純化肝臟枯否細胞的方法，包括在無菌條件下進行以下步驟:
[0005]第一步、建立肝臟機械灌注系統，在離體的肝臟、門靜脈、肝下下腔靜脈及行門靜脈置管并固定，管中注入0.1ml肝素，在右心房行上腔靜脈置管并固定，結扎肝下下腔靜脈后，分別將門靜脈置管和上腔靜脈置管連接至機械灌注蠕動栗形成閉合環路；
[0006]第二步、獲得細胞，利用肝臟機械循環灌注系統，依次行肝臟灌注消化，切取肝臟置于培養皿內，分離去除肝臟包膜，將細胞懸液經200目濾網濾過，轉至離心管后置于旋轉搖蕩器，37°C、140rpm震蕩10分鐘，50G離心I分鐘后取上清，再150G離心8分鐘棄上清，即得富含肝非實質性細胞懸液；
[0007]第三步、免疫磁珠三標兩步法分離F4/80+⑶I lb—roi lc—枯否細胞，先進行陰選，根據細胞計數結果，加入相應劑量⑶I Ib FITC，⑶I Ic PE抗體，4°(:15分鐘，PBS洗滌一次，同時加入Ant1-PE Microbeads和Ant1-FITC Microbeads，4°C15分鐘，LS分選柱行陰選，收集過磁柱后的細胞懸液;再進行陽選，根據陰選后細胞懸液細胞數量，加入相應劑量的F4/80APC抗體，4°C 15分鐘，PBS洗滌一次，加入Ant1-APC Microbeads，4°C 15分鐘，MS分選柱行陽選，收集磁柱中的細胞，即為F4/80+⑶I lb—OTl lc—枯否細胞；
[0008]第四步、純度檢測，取肝臟機械循環灌注后15級細胞重懸于100微升PBS中，加入CDllb FITC、CDllc PE、F4/80APC流式抗體，4°C避光孵育30-45分鐘，PBS洗滌兩次，流式細胞儀檢測細胞表型和純度。
[0009]上述方法的所述第二步中，消化的條件為EMEM 4ml/min*10min,0.45%Pronase4ml/min*15min，0.02%Collagenase 4ml/min*8min。離心管內含有 10yg/ml、40ml的DNase。
[0010]免疫磁珠分選是一種新型細胞分選技術。磁珠結合細胞表面抗原的特異性標記后通過陰選或陽選獲得目標細胞，該方法獲得的目的細胞具有操作簡易、耗時短、純度高、細胞活性損傷小等優點。然而，枯否細胞的表面分子標記較為復雜，無公認的特異性標記，因此尚無磁珠分選枯否細胞的相關報道。F4/80是小鼠單核巨噬細胞的表面標記物之一，主要表達于樹突狀細胞，枯否細胞和多形核白細胞，具有F4/80+表型的枯否細胞擁有更強的吞噬能力和活性氧生成能力。CDllc常作為樹突狀細胞特異性表面分子標記之一并與巨噬細胞激活相關。本發明首次通過肝臟機械循環灌注結合免疫磁珠三標兩步法獲得了純度高、活性好的F4/80+⑶11c—枯否細胞。建立了一種能夠分離純化具有F4/80+⑶11c—表型的枯否細胞的方法。按照本發明的方法所分選出的F4/80+CD11C—枯否細胞亞群，亦有更高的內吞活性及氧自由基生成能力，更低的IL-10，IL-12p40和TNF分泌，更為符合機體處于免疫穩態時枯否細胞的功能狀態，而這是傳統的密度梯度離心法和貼壁法所無法完成的。另外，本發明采用的肝臟機械循環灌注，其優勢如下:1，灌注速度由機器控制，避免人為操作不當壓力過大導致灌注液漏出或肝臟撕裂而致實驗失敗;2，灌注液循環使用，減少灌注液用量，降低了實驗成本;3，密閉系統，整套灌注系統處于密閉環路中，最大可能減少了污染機會;4，減少了人為操作步驟和實驗工作量。本發明首次通過小鼠肝臟機械循環灌注和免疫磁珠三標兩步法成功分離了肝臟枯否細胞，該方法獲得的枯否細胞純度高、活性好、操作簡單、可推廣性強，且具有特定的F4/80+CDllc—表型，具有更強的巨噬細胞特征。該細胞分選技術的成功建立，為枯否細胞的進一步功能研究提供了一種新的實驗方法。
【附圖說明】
[0011 ]圖1為肝臟機械灌注系統示意圖。
[0012]圖2為磁珠分選法和梯度離心法結果對比圖。
[0013]圖3為分離后的Kupffer細胞圖。
[0014]圖4為本發明的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0015]實施例
[0016]實驗材料
[0017]1.1小鼠選擇
[0018]從南京醫科大學動物實驗中心獲得C57BL/6小鼠。
[0019]1.2所需試劑和實驗器材
[0020]DMEM/Ham，s F-12 1:1 I X 培養基(Hyclone cat#SH30023.0I)、Pronase(Boehringer Mannheim cat#1459643)、Collagenase(type IV,sigma cat#C3155)、DNase(sigma cat#:D4527)、CDllc PE流式抗體(Miltenyi B1tec Order N0130-097-982)、Ant1-PE Microbeads磁珠(Miltenyi B1tec Matl20-0