一種高產風味乙酯釀酒酵母菌株及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，設及工業微生物的育種，特別是一種高產風味乙 醋釀酒酵母菌株及其構建方法。
【背景技術】
[0002] 釀酒酵母在發酵過程中產生的醋類，呈現果香味，是酒精飲料的特征風味物質，提 高醋類物質的含量，可W改善其風味質量。對于中國白酒而言，乙酸乙醋、己酸乙醋、乳酸乙 醋和下酸乙醋是我國白酒的四大主要香氣成分，直接決定了白酒產品質量。但在傳統發酵 中，W純種釀酒酵母為主發酵生產的普通白酒，醋香物質含量低，成品酒品質差。而高檔白 酒中含量較高的醋類物質則主要由酒曲中的異常漢遜酵母等野生生香酵母和己酸菌等魯 泥微生物混合發酵產生，但野生酵母酒精發酵效率低，導致發酵周期延長，生產成本提高， 降低了白酒的生產效率;魯泥微生物會帶來澀味、酸味等異味物質，對白酒品質產生不利影 響。
[0003] 因此，選育適量高產醋的釀酒酵母菌株，使其在保持優良酒精發酵特性的同時提 高飲料酒中醋含量，對于飲料酒產品質量提高與穩定，對于傳統白酒的優質高產都具有重 要意義。
[0004] 釀酒酵母在發酵條件下產生的醋類主要分為乙酸醋類和乙基醋類，其中乙酸醋類 主要有乙酸乙醋、乙酸異戊醋；乙基醋類主要是己酸乙醋、辛酸乙醋、十二酸乙醋、十六酸乙 醋等中長鏈脂肪酸乙醋。中長鏈脂肪酸乙醋的合成主要受脂肪酸合成酶的調控，脂肪酸合 成酶呈復合六聚體形式，由α和0亞基構成，分別由FAS2和FAS1基因編碼，其中FAS1起主要作 用。并且肌醇介導的負調控基因0ΡΙ1，在轉錄水平對FAS1的表達有一定抑制作用，會導致中 長鏈脂肪酸乙醋的合成受到抑制。而且過表達FAS1同時敲除0ΡΙ1基因對乙酸乙醋的合成也 有一定調控作用，目前還沒有相關報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是解決釀酒酵母自身產醋能力較低的問題，提供一種高產風味乙醋 釀酒酵母菌株及其構建方法，所述方法是在釀酒酵母出發菌株中過表達脂肪酸合成酶基因 0亞基的編碼基因 FAS1，同時敲除肌醇介導的負調控基因0ΡΙ1，步驟如下：
[0006] (1)先將強啟動子PGKlp-PGKlt片段插入到表達載體上，再將通過PCR方法獲得的 來源于釀酒酵母的FAS1基因插入到啟動子PGKlp和終止子PGKlt之間，在此基礎上將KanMX 抗性標記插入表達質粒，最終得到重組質粒。
[0007] (2) W重組質粒為模板擴增出含有FAS1基因、強啟動子PGKlp-PGKlt和KanMX標記 的片段I，WPCR的方法獲得0PI1基因的上游同源臂片段0A和下游同源臂片段0B，用One- step ISO Assembly of Overlapping dsDNA 連接法將片段 0A、I、0B 連接到 一起得到連接片 段II，WII為模板擴增重組片段HI化轉入出發菌株中，得到過表達FAS1同時敲除0PI1的重 組菌株。
[000引具體如下：
[0009] (1)重組質粒的構建
[0010] 質粒pPGKl為模板，擴增其上的強啟動子片段PGKlp-PGKlt，并連接到表達載體 上化p352上，得到質粒化P-P;
[00川擬出發菌株的總DNA為模板，擴增出FAS1基因片段，并將其插入到Y邱-P質粒上的 啟動子PGKlp和終止子PGKlt之間，得到質粒化P-PF1;
[0012] 3將來源于質粒pUG6上的loxP-KanMX-loxP基因片段連到質粒化P-PF1上，得到重 組質粒化P-PF化；
[OOK] (2)過表達FAS1基因同時敲除0PI1基因重組菌株的構建
[0014] ① WPCR的方法從釀酒酵母全基因組上獲得0PI1基因的上游同源臂0A和下游同源 臂0B，同時W重組質粒化P-PF1K為模板，擴增出含有FAS 1基因、強啟動子PGK1P-PGK11和 KanMX標記的片段I，將片段0A、I、0B通過One-Step ISO Assembly of Overlapping dsDNA 法連接到一起形成片段II;
[0015] ②W片段II為模板，擴增得到重組盒III，用醋酸裡轉化法將重組片段轉化入出發 菌株中，得到過表達FAS 1基因同時敲除0P11基因的重組菌株。
[0016] 本發明出發菌株為釀酒酵母AY15的單倍體巧，重組菌株命名為巧-FAS1。
[0017] 所述FAS1基因的核巧酸序列如序列表中SEQ ID N0:1;
[001引所述0PI1基因的核巧酸序列如序列表中SEQ ID N0:2;
[0019] 有益效果：
[0020] 本發明選用強啟動子PGK1過表達脂肪酸合成酶β亞基的編碼基因 FAS1，同時敲除 肌醇介導的負調控基因0ΡΙ1，獲得了高產乙醋的釀酒酵母菌株。
[0021] 本發明所獲得的高產乙醋釀酒酵母基因工程菌株Q5-FAS1與初始釀酒酵母菌株巧 相比:該釀酒酵母菌株除殘糖含量較初始菌株稍高外，其他發酵性能不受影響，模擬玉米原 料液態白酒發酵5天后，中長鏈和短鏈乙醋含量都得到了明顯提高，其中，乙酸乙醋含量提 高了 2.61倍；己酸乙醋、辛酸乙醋、癸酸乙醋和十二酸乙醋的含量分別提高了 1.75、2.77、 1.29和2.30倍;十四酸乙醋和十六酸乙醋含量提高較少，分別提高了 1倍和56.7%。
【附圖說明】
[0022] 圖1重組質粒化P-PF化的構建流程示意圖；
[0023] 圖2構建重組質粒化P-PF化的PCR驗證電泳圖；
[0024] 圖3重組片段的獲得W及重組片段與酵母基因組的同源重組示意圖；
[0025] 圖4重組片段連接電泳圖；
[00%]圖5重組菌株驗證電泳圖；
【具體實施方式】
[0027]下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段 均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的而非限制本發明的 范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本 發明實質和范圍的前提下，對運些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬于本發明的保護范圍。
[0028] 本發明所使用的釀酒酵母單倍體菌體是可W采用任何來源的釀酒酵母單倍體菌 株。
[0029] 實施例1:高產風味乙醋釀酒酵母基因工程菌株的構建
[0030] (1)基因工程菌株的構建
[0031] l)Yep-PF化質粒的構建
[0032] WYep352為基礎質粒構建重組質粒Yep-PFIK，構建流程如圖1所示，將強啟動子 PGK1通過Ba恤I/sall雙酶切連入化p352質粒，得到質粒化P-P; WAY15的單倍體巧為模板 PCR擴增得到FAS1基因，使用I址usion連接酶通過化〇1單酶切插入到化P-P質粒上的啟動子 PGKlp和終止子PGKlt之間，得到質粒化P-PF1; WpUG6為模板PCR擴增得到1613bp的KanMX基 因，用Smal分別單酶切質粒化P-PF1和片段KanMX，再用SolutionI連接酶連接，構成重組質 粒化P-PF化，整個過程所用的引物序列如表1。
[0033] 表 1PCR 引物
[0034]
[0035] 圖2為質粒化P-PF化的驗證電泳圖：其中泳道Μ為15000bp DNALadder Marker;泳 道1為受體菌基因組PCR擴增得到的6156bp FASl;泳道2為W化p-PF化質粒為模板擴增得到 的6156bp FAS1;泳道3為W化P-PF化質粒為模板擴增得到7668bp PGKlp+FASl片段;泳道4 為W化P-PF化質粒為模板擴增得到6472bp FASl+PGKlt片段；泳道5為pUG6質粒擴增得到 1613bp KanMX片段;泳道6為W化P-PF化質粒為模板擴增得到1613bp KanMX片段。
[0036] 2)重組盒HI的獲得W及重組釀酒酵母單倍體的獲得
[0037] WAY15的單倍體巧為模板PCR擴增得到0PI1基因上游同源臂0A和下游同源