人乳頭瘤病毒16型單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及分子病毒學和免疫學領域，具體而言，本發明設及人乳頭瘤病毒16型 雜交瘤細胞系及其產生的單克隆抗體W及編碼它們的序列，和它們進行診斷、預防和治療 的應用。
【背景技術】
[0002] 人乳頭瘤病毒(HPV)是無包膜的雙鏈小DNA病毒，主要侵及人的上皮組織，進而誘 發各種良、惡性增生病變。高危型HPV感染與多種惡性腫瘤的發生相關，低危型的HPV感染則 弓旭肛口和生殖痛。HPV感染的流行范圍廣，所引發的相關致死性的惡性腫瘤和多種性傳播 疾病對人類健康具有嚴重的危害性，開發安全有效的預防或治療性疫苗具有重大意義。
[0003] HPV病毒顆粒直徑為55~60皿，核衣殼呈20面體對稱，由72個主要衣殼蛋白L1的五 聚體及次要衣殼蛋白L2組成。大量研究證實，冊V L1蛋白是HPV疫苗的主要祀蛋白。在多種 表達系統中表達的HPV L1蛋白無需L2蛋白輔助即可形成在形態結構與天然病毒顆粒相似 的類病毒顆粒(Virus-LlkeParticle，VLP)。重組HPV L1-VLP疫苗已經成功上市并用于預防 HPV感染及由此導致的宮頸癌、尖銳濕痛等疾病，并充分證明了 L1-VLP具有與野生同型病毒 相同的抗原性和免疫原性，其結構與天然HPV高度相似，保留了天然病毒的絕大多數中和表 位，可誘導高滴度的中和抗體。
[0004] 國家食品藥品監督管理局（CFDA)在《預防用疫苗臨床前研究技術指導原則》中指 出："在生產工藝的各個環節和步驟中的產品均應建立相應的監控標準，W便后續工藝的進 行，保證產品的質量、工藝的穩定性"，同時要求"在半成品和成品階段的質量控制至少包括 鑒別試驗" 在HPV疫苗研發過程中，需要開展四個方面的測定，即型別鑒定實驗、抗原含量檢測和 體外效力測定。其方法均可W采用雙抗體夾屯、法化ISA。因此，在疫苗研究中，單克隆抗體是 疫苗抗原質控的重要工具，尤其是具有特異性和中和活性的抗體在疫苗研發中具有不可替 代的作用。
[000引目前國外已上市的人乳頭瘤病毒疫苗主要有Ξ種，分別是：2006年首次上市的由 16、18、6和11型人乳頭瘤病毒1^重組蛋白構成的四價疫苗化曰'(1曰311)，2007年首次上市的 由16和18型乳頭瘤病毒L1重組蛋白構成的二價疫苗(Cervarix)，W及2014年12月首次上市 的由6、11、16、18、31、33、45、52和58型人乳頭瘤病毒1^重組蛋白構成的九價疫苗化曰'(1曰311 9)。本發明提供了最多可針對九價范圍內HPV16的特異性和中和活性的單克隆抗體，利用其 中的兩株制備的化ISA檢測試劑盒，可W特異性地用于快速鑒別并定量HPV16 L1蛋白，可W 廣泛應用于臨床檢測和目前疫苗廠家生產疫苗過程中的質檢，對女性的健康發展和公共衛 生防控將具有重要的意義。
[0006]
【發明內容】
[0007] 本發明的第一個目的是提供能夠識別HPV16的單克隆抗體W及產生該抗體的雜交 瘤細胞系。
[0008] 本發明的第二個目的是提供一種用于檢測HPV16的雙抗體夾屯屯LISA試劑盒。
[0009] 本發明的第Ξ個目的在于提供單克隆抗體的制備方法。
[0010] 本發明的第四個目的在于提供HPV的抗原檢測試劑盒的制備方法。
[0011] 本發明實驗目的是通過如下技術方案實現： 本發明提供的單克隆抗體，其是WHPV16 L1五聚體蛋白作為免疫原，制備獲得。具體地 說是HPV16 L1五聚體蛋白作為免疫原免疫小鼠，采用雜交瘤技術經過細胞融合并篩選得到 能持續、穩定分泌抗HPV16 L1的雜交瘤細胞株，由各細胞株分泌得到單克隆抗體。
[0012] 在一個優選的實施方案中識別人乳頭瘤病毒16型的單克隆抗體，由雜交瘤細胞株 4612產生，其〔610：保藏號為11298。
[0013] 本發明公開的由雜交瘤細胞株4G12產生，其CGMCC保藏號為11298單克隆抗體，包 含至少1個抗體重鏈可變區和至少1個抗體輕鏈可變區，并且其中所述抗體輕鏈可變區具有 CDR序列CD化1、CD化2或/和CD化3，其中： CD化1包括沈Q ID NO: 1; CD化2包括沈Q ID NO:2; CD化3包括沈Q ID NO:3。
[0014] 由雜交瘤細胞株4G12產生，其CGMCC保藏號為11298單克隆抗體重鏈可變區具有選 自CDRH1、CDR肥或/和CD畑3，其中： CDRH1 包括沈Q ID N0:4; CDR肥包括沈Q ID NO:5; CDR冊包括沈Q ID NO:6。
[0015] 在一個優選的實施方案中人乳頭瘤病毒16型LI蛋白的單克隆抗體或抗原結合片 段，包含至少1個抗體輕鏈可變區包括SEQ ID NO:7和至少1個抗體重鏈可變區包括SEQ ID N0:8。
[0016] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種分離的核酸，該核酸編碼本發明抗體的 至少一個輕鏈可變區沈Q ID NO:7和重鏈可變區沈Q ID NO:8。
[0017] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種核酸的表達載體，該載體轉染宿主細胞 時所述核酸與宿主細胞識別的控制序列有效連接。
[0018] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種表達載體的宿主細胞。
[0019] 在一個優選的實施方案中本發明提供另一種人乳頭瘤病毒16型的單克隆抗體，其 特征在于該單克隆抗體由雜交瘤細胞株5A6產生，其CGMCC保藏號為11299。
[0020] 由雜交瘤細胞株5A6產生，其CGMCC保藏號為11299的單克隆抗體，包含至少1個抗 體重鏈可變區和至少1個抗體輕鏈可變區，并且其中所述抗體輕鏈可變區具有CDR序列 CD化1、CD化2或/和CD化3，其中： CD化1包括沈Q ID NO:9; CD化2包括沈Q ID NO: 10; CD化3包括沈Q ID NO: 11。
[0021 ]本發明公開的由雜交瘤細胞株5A6產生，其CGMCC保藏號為11299的單克隆抗體的 重鏈可變區具有選自CD畑1、CD畑2或/和CD畑3，其中： CDRH1 包括沈Q ID N0:12; CDR肥包括沈Q ID N0:13; CDR冊包括沈Q ID N0:14。
[0022] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種識別人乳頭瘤病毒16型的單克隆抗體 或抗原結合片段，其特征在于其中包含至少1個抗體輕鏈可變區包括SEQ ID NO: 15和至少1 個抗體重鏈可變區包括沈Q ID NO: 16。
[0023] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種分離的核酸，其編碼本發明抗體的至少 一個輕鏈可變區沈Q ID NO: 15和重鏈可變區沈Q ID NO: 16。
[0024] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種核酸的表達載體，其載體轉染宿主細胞 時所述核酸與宿主細胞識別的控制序列有效連接。
[0025] 在一個優選的實施方案中本發明提供一種包括表達載體的宿主細胞。
[0026] 另一方面本發明提供一種檢測HPV16 L1的試劑盒，包括本發明公開的單克隆抗體 或抗原結合片段。
[0027] 本發明公開的檢測HPV16 L1的試劑盒為用于檢測HPV16 L1抗原的雙抗體夾屯、 ELISA試劑盒，還包括可檢測的標記:放射性同位素、巧光物質、發光物質、有色物質和/或 酶。
[0028] 另一方面本發明提供一種檢測一種特異性檢測人乳頭瘤病毒16型L1蛋白的組合 物，該組合物包含本發明的單克隆抗體或抗原結合片段。
[0029] 人乳頭瘤病毒16型的單克隆抗體可按如下方法制備： 1) 利用的人乳頭瘤病毒16型L1蛋白的五聚體作為免疫原，純化后免疫Ba化/c小鼠，并 采血，用間接化ISA方法檢測血清效價，選擇血清效價高的Ba化/c小鼠進行加強免疫，并從 該小鼠體內制備得到免疫脾細胞； 2) 制備骨髓瘤細胞(SP2/0)懸浮液并注射Balb/c小鼠，待小鼠長出實體瘤后制備骨髓 瘤細胞，將骨髓瘤細胞與步驟1)所述的免疫脾細胞進行融合，制備出雜交瘤細脆，檢測篩選 效價高的雜交瘤細