一種青蒿pdr亞家族轉運蛋白及其功能驗證方法和應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于基因工程技術領域，具體設及一種青葛PDR亞家族轉運蛋白及其功能 驗證方法和應用。
【背景技術】
[0002] 青葛(Artemisia annua L.)是菊科葛屬的一年生草本植物。其地上部分所提取的 含有過氧橋的倍半祗內醋氧化物一一青葛素，是目前應用最廣泛，療效最好的抗追疾藥物， 特別是對腦型追疾和抗氯哇追疾更加有效。目前，青葛素聯合療法(ACTS)是世界衛生組織 推薦的最有效的治療追疾的方法。但其青葛素在植物青葛中的含量低，尚無法完全滿足全 球的市場需求。青葛具有分泌型腺毛（g 1 andu 1 ar tr i chome S )和非分泌型腺毛 (nonglanduladrichomes)。在青葛葉片的正面和背面、莖桿、花上都大量存在分泌型腺毛， 運里是大量次生代謝物的累積場所，青葛素也被認為儲存于此處。
[0003] ATP結合盒式(ATP binding cassette,ABC)轉運蛋白是一大類非常多樣化非常特 殊的超級家族。大部分ABC轉運蛋白直接參與到各種分子的跨膜運輸。此轉運蛋白利用水解 ATP釋放能量對細胞質內多種生物分子進行跨膜運輸，轉運底物包括:脂類、氨基酸、生物 堿、祗類物質等。根據對于細胞質的轉運方向可W粗略分為攝取轉運蛋白（importer)和外 排轉運蛋白（exporter) dABC轉運蛋白的特征是具有ATP結合區域（ATP-binding cassette)，也被稱為核酸結合區域(nucleotide-binding domain，NBD)，具有一些非常保 守的模序（motif),包括Walker A和Walker B序列、ABC signature motif、H loop和Q loop。植物中有大量的ABC轉運蛋白，近年來的研究表明植物ABC轉運蛋白不僅僅設及到植 物激素、醋類、金屬離子、次生代謝物、外源化學物質的轉運有關，而且對于植物和病原體互 作W及離子通道的建成都有重要作用。多向耐藥性(pleiohopic drug resistance，PDR) 轉運蛋白屬于ABC轉運蛋白家族G亞家族，包含反向的核酸結合區域-跨膜結合區域(NW- TMD)類型的轉運蛋白。
【發明內容】
[0004] 針對青葛素在植物青葛中的含量低，無法有效滿足市場需求的問題，發明人考慮 到如果通過對青葛分泌型腺毛轉錄組數據庫分析，篩選出參與青葛素合成途徑相關轉運蛋 白，并且驗證其功能，那么就可W利用基因工程手段提高轉運蛋白的轉運效率，從而提高青 葛中青葛素的含量。AaPDRl是發明人從青葛中克隆得到的一種ABC轉運蛋白，屬于青葛PDR 轉運蛋白亞家族，因此是一種青葛PDR亞家族轉運蛋白，命名為AaPDRl。為了驗證AaPDRl的 功能，發明人利用酵母突變體AD12345678體外轉運實驗證明AaPDRl是青葛素直接前體物質 二氨青葛酸的從胞內到胞外的外排轉運蛋白。并且采用基因工程手段，將該AaPDRl轉運蛋 白反義干擾載體轉化青葛，可W顯著抑制青葛素的合成。因此，克隆AaPDRl基因及其外排功 能的研究對于提高青葛素含量和生產代謝產物的基因工程育種具有重要意義。經對現有技 術文獻的檢索發現，尚未發現有與本發明的AaPDRl基因序列相關的報道。
[0005] 本發明提供一種青葛PDR亞家族轉運蛋白，所述青葛PDR亞家族轉運蛋白具有w下 一種或者兩種特征：
[0006] 1)所述青葛PDR亞家族轉運蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID N0:2所示的氨基酸序 列;或者所述青葛PDR亞家族轉運蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；
[0007] 2)所述青葛PDR亞家族轉運蛋白由在高嚴謹條件與編碼氨基酸序列為SEQ ID NO: 2所示的蛋白質的核酸的互補鏈雜交的核酸編碼。
[000引進一步地，所述青葛PDR亞家族轉運蛋白由如SEQ ID NO: 1所示的核酸編碼。
[0009] 進一步地，所述青葛PDR亞家族轉運蛋白存在于植物青葛(Ademisia annua L.) 中，所述青葛PDR亞家族轉運蛋白具有轉運二氨青葛酸的功能。"高嚴謹條件"的核酸雜交一 般是指本領域技術人員認可的低鹽、高溫條件下的核酸雜交，是本領域的公知常識。
[0010] 本發明實際上是提供了一種多膚或者一種蛋白質，該多膚或者蛋白質的氨基酸序 列如沈Q ID NO:2所示。
[0011] 本發明還提供如上所述的青葛PDR亞家族轉運蛋白的功能驗證方法，包括W下步 驟：
[0012] (1)從青葛cDNA文庫中克隆到所述青葛PDR亞家族轉運蛋白的核酸序列，如SEQ ID N0:1所示，即AaPDRl基因；
[OOK] (2)把AaPDRl基因可操作性地連接于酵母表達調控序列，形成含AaPDRl基因的酵 母表達載體；
[0014] (3)將含所述AaPDRl基因的酵母表達載體轉入酵母菌AD12345678,得到轉基因酵 母菌，所述轉基因酵母菌獲得了二氨青葛酸外排的功能，從而驗證了所述青葛PDR亞家族轉 運蛋白具有外排二氨青葛酸的功能。
[0015] 本發明還提供驗證如上所述的青葛PDR亞家族轉運蛋白功能的另一種方法，包括 W下步驟：
[0016] (1)從青葛cDNA文庫中克隆到所述青葛PDR亞家族轉運蛋白的核酸序列，如SEQ ID NO :1所示，即AaPDRl基因；
[0017] (2)把AaPDRl基因可操作性地連接于表達調控序列，形成含AaPDRl基因的植物反 義干擾表達載體；
[0018] (3)將含所述AaPDRl基因的植物反義干擾表達載體轉化根癌農桿菌邸105,獲得具 有所述干擾表達載體的根癌農桿菌菌株；
[0019] (4)利用所述步驟3構建的根癌農桿菌菌株轉化青葛，經卡那霉素篩選得到抗性 苗，再經PCR檢測為陽性的植株即為轉基因青葛；
[0020] (5)對獲得的所述轉基因青葛進行青葛素、二氨青葛酸和青葛酸含量測定，進而獲 得青葛素合成受抑制的青葛植株，從而驗證了所述青葛PDR亞家族轉運蛋白具有影響青葛 素合成的功能。
[0021] 進一步地，可W將上面兩種驗證方法合并，即包括W下步驟：
[0022] (1)從青葛cDNA文庫中克隆到所述青葛PDR亞家族轉運蛋白的核酸序列，如SEQ ID NO :1所示，即AaPDRl基因；
[0023] (2)把AaPDRl基因可操作性地連接于酵母表達調控序列，形成含AaPDRl基因的酵 母表達載體；
[0024] (3)將含所述AaPDRl基因的酵母表達載體轉入酵母菌AD12345678,得到轉基因酵 母菌，所述轉基因酵母菌獲得了二氨青葛酸外排的功能，從而驗證了所述青葛PDR亞家族轉 運蛋白具有外排二氨青葛酸的功能；
[0025] (4)把AaPDRl基因可操作性地連接于表達調控序列，形成含AaPDRl基因的植物反 義干擾表達載體；
[00%] (5)將含所述AaPDRl基因的植物反義干擾表達載體轉化根癌農桿菌邸105,獲得具 有所述干擾表達載體的根癌農桿菌菌株；
[0027] (6)利用所述步驟5構建的根癌農桿菌菌株轉化青葛，經卡那霉素篩選得到抗性 苗，再經PCR檢測為陽性的植株即為轉基因青葛；
[0028] (7)對獲得的所述轉基因青葛進行青葛素、二氨青葛酸和青葛酸含量測定，進而獲 得青葛素合成受抑制的青葛植株，從而驗證了所述青葛PDR亞家族轉運蛋白具有影響青葛 素合成的功能。
[0029] 優選地，采用引物AaPDRl-FPl (女曰SEQ ID N0:3所示）： AAACCCTTTTTGCTTTCTAATTGATTCA 和 AaPDRl-RPl (女日 SEQ ID N0:4 所示）： TTATCTCTTCTGGAAATTAAAGGA 對進行 AaPDRl 基因克隆。
[0030] 優選地，將AaPDRl基因構建在酵母表達載體上，為了方便表達載體的構建，正向引 物中引入了 Spe 11的酶切位點，反向引物中引入了 Ps11的酶切位點，引物為:Spe I-AaPDRl- RP(如沈Q ID N0:6所示）：CTTGATATCGAATTCCTGCAGTTATCTCTTCTGGAAATTAA。
[0031 ]優選地，將AaPDRl基因部分序列構建在植物反義表達載體上，為了方便表達載體 的構建，正向引物中引入了BamHI的酶切位點，反向引物中引入了SacI的酶切位點，引物為： PDRl-BamHI-RP(如沈Q ID N0:8所示）：CGGGATCCCCATTGTACGTCACCTTTCCAG。
[0032] 優選地，通過AaPDRl基因所在表達盒上游的35S啟動子區域和AaPDRl分別設計正 向引物（35SFP:GAAGATGCCTCTGCCGACAGTG，如SEQ ID N0:9所示）和反向引物（AaPDRl- BamHI-RP: CGGGATCCCCATTGTACGTCACCTTTCCAG，如SEQ ID NO: 8所示）對轉基因青葛的 AaPDRl基因進行檢測。
[0033] 進一步地，上述轉化根癌農桿菌E化05的具體方法是采用凍融法進行轉化。
[0034] 進一步地，青葛素含量采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法化PLC-ELSD)進行 測定。
[0035] 本發明還保護含有如上所述的青葛PDR亞家族轉運蛋白的核酸序列的表達載體或 宿主細胞。優選地，所述表達載體包括含AaPDRl基因的酵母表達載體;所述宿主細胞包括含 AaPDRl基因的酵母表達載體的酵母菌AD12345678。
[0036] 本發明還保護如上所述的青葛PDR亞家族轉運蛋白在提高青葛素含量的青葛育種 中的應用，或者在制備抗追疾藥物中的應用。進一步地，本發明設及如上所述的青葛PDR亞 家族轉運蛋白在酵母菌中參與二氨青葛酸從胞內向胞外外排轉運，其二氨青葛酸外排功能 在青葛素合成途徑和積累的應用。
[0037] 本發明提供了一種青葛PDR亞家族轉運蛋白，并WAaPDRl為例提供了其氨基酸序 列（如SEQ ID N0:2所示)和核巧酸序列（如SEQ ID N0:1所示），同時驗證了AaPDRl參與二氨 青葛酸的從胞內向胞外轉運。A