大豆蛋白GmAIRP1及其編碼基因在培育抗逆性植物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，尤其設及一種大豆蛋白GmAIRPI及其編碼基因在培育 抗逆性植物中的應用。
【背景技術】
[0002] 鹽堿、干旱等非生物脅迫是限制植物生長發育的主要環境因子。運些環境因子導 致植物體內發生一系列的生理代謝反應，表現為代謝和生長的可逆性抑制，嚴重時甚至引 起不可逆傷害，導致整個植株死亡。植物在長期的進化中，逐漸形成了一系列應答逆境脅迫 的防御機制，其中泛素/26S蛋白酶體途徑是應答脅迫的一個重要途徑。泛素連接酶E3決定 祀蛋白的特異性識別，在泛素化過程中具有至關重要的作用。
[0003] 大豆是我國重要的經濟作物和糧食作物，干旱、鹽堿等非生物脅迫導致其產量和 品質均大大下降，既不能滿足國內人民生活的需求，也極大限制了大豆的出口。探究泛素/ 26S蛋白酶體途徑在大豆抵御非生物脅迫中的功能與作用機制、挖掘相關調芐基因，將有助 于推動大豆抗逆遺傳育種。
【發明內容】
[0004] 本發明一個目的是提供如下1)-3)中任一種物質的新用途。
[0005] 本發明提供的如下1)-3)中任一種物質在調控植物抗逆性中的應用：1)蛋白；2)編 碼蛋白的DNA分子；3)含有編碼蛋白的DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組 菌；
[0006] 所述蛋白為如下（1)或(2):
[0007] (1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[000引（2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由（1)衍生的蛋白質。
[0009] 上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘 基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010] 本發明另一個目的是提供如下1)-3)中任一種物質的新用途。
[0011] 本發明提供的如下1)-3)中任一種物質在培育抗逆植物中的應用：
[001^ 1)蛋白；
[001引 2)編碼蛋白的DNA分子；
[0014] 3)含有編碼蛋白的DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌；
[0015] 所述蛋白為如下（1)或(2):
[0016] (1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0017] (2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由（1)衍生的蛋白質。
[001引上述應用中，所述編碼蛋白的DNA分子是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[0019] 1)序列表中序列1所示的dna分子；
[0020] 2)在嚴格條件下與1)所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列2所示的氨基 酸序列組成的蛋白質的DNA分子；
[0021] 3)與1)所限定的DNA分子至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98%或至少具 有99%同源性且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的DNA分子。
[0022] 上述嚴格條件可為在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0.1 % SDS和 1 X SSC，0.1 % SDS各洗膜一次。
[0023] 上述應用中，所述調控植物抗逆性為提高植物抗逆性。
[0024] 上述應用中，所述抗逆為抗干旱。
[0025] 上述應用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物;所述雙子葉植物具體為煙草。 [00%]本發明第Ξ個目的是提供一種重組載體。
[0027] 本發明提供的重組載體，為將編碼蛋白的DNA分子插入表達載體中，得到表達蛋白 的重組載體；
[0028] 所述蛋白為如下（1)或(2):
[0029] (1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0030] (2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由（1)衍生的蛋白質。
[0031] 上述重組載體中，所述編碼蛋白的DNA分子是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[0032] 1)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0033] 2)在嚴格條件下與1)所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列2所示的氨基 酸序列組成的蛋白質的DNA分子；
[0034] 3)與1)所限定的DNA分子至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98%或至少具 有99%同源性且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的DNA分子。
[00巧]上述重組載體為將序列表中序列1所示的GmAIRPl基因替換表達載體PBI121的 BamHI和Sac I酶切位點間DNA片段得到的載體，命名為地1121 -GmA IRP1。
[0036] 上述轉基因植物的抗干旱性高于所述目的植物體現在干旱脅迫或PEG脅迫下，轉 GmAIRPl煙草的脯氨酸含量高于野生型煙草。
[0037] 本發明的實驗證明，本發明將基因 GmAIRPl轉入煙草中，得到轉GmAIRPl煙草，用干 旱脅迫條件處理轉GmAIRPl煙草和野生型煙草，轉GmAIRPl煙草長勢優于野生型煙草;對兩 組植株的？00八41\104、脯氨酸含量測定結果顯示，轉基因植株清除自由基和調節滲透壓的 能力總體高于野生植株，掲示GmAIRPl可能參與了植物的抗干旱調控過程，為培育抗干旱性 植物奠定基礎。
【附圖說明】
[003引圖1為GmAIRPl基因的RT-PCR擴增結果。
[0039] 圖2為100ymol/L ΑΒΑ誘導下GmAIRPl基因的表達模式。
[0040] 圖3為20%PEG6000誘導下GmAIRPl基因表模式。
[0041 ]圖4為農桿菌中重組質粒的PCR鑒定。
[0042] 圖5為轉GmAIRPl煙草的PCR產物電泳檢測結果。
[0043] 圖6為轉GmAIRPl煙草的RT-PCR檢測。
[0044] 圖7為轉GmAIRPl煙草的發育進程。
[0045] 圖8為野生型煙草種子與轉GmAIRPl煙草種子對比。
[0046] 圖9為轉GmAIRPl煙草的抗干旱表型分析。
[0047] 圖10為20%PEG6000處理下轉GmAIRPl煙草和野生煙草中的P0D、CAT和MDA含量。 [004引圖11為20%PEG6000處理下轉GmAIRPl煙草和野生煙草中脯氨酸含量。
【具體實施方式】
[0049] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0050] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0051] 合豐45大豆(不同株型大豆群體分布對產量形成的影響.大豆科學，2005,29(4): 6:34-637.);
[0052] 龍江981煙草(烤煙新品種龍江981的選育及其特征特性.中國煙草科學，2015,36 (4):18-23.)
[0053] 農桿菌菌株為EHA105(影響根癌農桿菌EHA105感受態細胞轉化效率因素的研究. 熱帶生物學報，2012,3(1) :22-27.)
[0054] 植物表達載體質粒PBI121全長14肺，含有卡那霉素抗性，記載在如下文獻中：致病 疫霉NLP家族基因 PITG_10839的克隆和功能分析.中國農業科學，2014,47(5):895-902。
[005日]MS培養基，1/2MS培養基，卡那霉素化an),頭抱霉素（Cef)，利福平(Rif)、6BA，NAA 等。
[0化6] RNA提取試劑盒RNApr邱pure Plant Kit、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒DNA提 取試劑盒均購自天根生物有限公司；RNA反轉錄試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit 購自東洋紡生物有限公司；限制性內切酶BamHI和Sac I均購自肥B公司。ExTaq DNA聚合酶、 dNTP、氨節青霉素(Amp)購自寶生物(大連)有限公司。
[0057] 實施例UGmAIRPl基因的克隆及表達模式 [0化引 一、GmAIRPl基因的克隆
[0059] 利用primer premie;r5.0設計引物，并分別在引物5'端加上BamHI和SacI兩個限制 內切酶識別位點，引物序列如下：
[0060] GmAIRPl-Pl:5'CGGGATCCATGGGCGGTTGCTGTTGT 3' BamHI [0061 ] GmAIRPl-P2:5'GGAGCTCTTATTCAATGGGAGGGTCG 3'SacI
[0062] 提取合豐45大豆的總RNA，反轉錄得到cDNA作為模板，用GmAIRPl-Pl和GmAIRPl-P2 進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0063] PCR擴增產物電泳結果如圖1所示，M:化2000分子量標準；1~8 :PCR擴增產物，得到 約64化P大小的目的條帶。
[0064] 將上述PCR擴增產物與PMD-19T simple載體連接，轉化E.coli D冊α，通過藍白斑 篩選和PCR鑒定初步篩選出陽性克隆，對陽性克隆進行測序，結果該PCR產物具有序列表中 序列1所示的核巧酸，序列表中序列1所示的基因命名為GmAIRPl,該基因的開放閱讀框為序 列1第1-642位核巧酸，其編碼的蛋白命名為GmAIRPl，該蛋白的氨基酸序列為序列表中序列 2所示，該蛋白由213個氨基酸殘基組成。
[0065] 二、GmAIRPl基因在逆境脅迫和激素誘導下的表達模式分析
[0066] 1、逆境脅迫
[0067] 將合豐45大豆種子播種于賠石中，在溫度為28°C的溫室中培養，當幼苗長至第Ξ 片Ξ出復葉時，進行各種處理。
[0068] (1)干旱脅迫處理:在干燥的賠石中誘入含20%PFG6000的化agland溶液，處理0~ 24h；
[0069] (2)ABA處理:在干燥的賠