與水稻籽粒粒長和粒重相關蛋白及其編碼基因gl3-3與應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及植物基因工程技術領域，尤其設及與水稻巧粒粒長和粒重相關蛋白及 其編碼基因化3-3與應用。
【背景技術】
[0002] 粒重和粒形不僅是產量形成的重要因素之一，還影響聖白粒率、糖米率、精米率、 整精米率等品質性狀，從而影響稻米外觀、娠磨、蒸煮和營養等品質（Webb et al.，1991;石 春海等，1994 ;徐正進等，2004 ;孟慶虹等，2009)。發掘水稻粒重和粒形相關基因并明確其 功能，不僅為水稻高產及優質育種提供優異的基因資源，而且有助于明確水稻粒重和粒形 形成的分子機理，具有重要的理論和實踐意義。
[0003] 粒重受粒長、粒寬和粒厚等粒形性狀W及巧粒灌漿共同決定，均屬于數量遺傳。 目前已發現的控制水稻粒重的位點有近286個，其中精細定位的粒重的'L有gw3. 1 (Li et al.，2004)，qGW8. 1 狂ie et al.，2006)，gw9. 1 狂ie et al.，200的，qGL7 炬ai et al.，2010) 和 qGL7-2 (Shao et al.，2010)。已克隆粒長及粒重基因 GS3 (Fan et al.，2006)、GL3. 1 (Qi et al.，2012)、粒寬及粒重基因 GW2 (Song et al.，2007)、qSW5(Shomura et al.，2008 ;Weng et al.，2008;Wan et al.，2008)GS5 化i et al.，2011)和 GW8(Wang et al.，2012)。除此 之外，仍然有許多影響粒形的的'L通過近等基因系被定位到狂ing et al.,2002;Thomson et al.，2003;Li et al.，2004;Wang et al.，2012)。近些年來，水稻全基因組關聯分析取 得了重大突破，定位到了多個與粒形性狀相關聯的新位點化uang et al.，2010;Zhao et al.，2011出uang et al.，2012)。從W上定位和克隆的giL分布及數量情況來看，控制粒 長、粒重的基因可能還很多。
【發明內容】
[0004] 本發明的一個目的是提供與水稻巧粒粒長和粒重相關蛋白及其編碼基因。
[000引本發明提供的蛋白，命名為化3-3,是如下1)或2)的蛋白質：
[0006] 1)由序列表中序列3所示的氨基酸殘基組成的蛋白質；
[0007] 2)將1)所示的蛋白質的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質。
[0008] 上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸 殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0009] 編碼上述蛋白的DNA分子也是本發明保護的范圍。
[0010] 上述DNA分子為如下1) -5)中任一所述的DNA分子： W11] 1)編碼區為序列表中序列2所示的DNA分子；
[0012] 2)編碼區為序列表中序列2自5'末端第10-1570位核巧酸； 陽013] 3)編碼區為序列表中序列2自5'末端第102-1106位核巧酸；
[0014] 4)在嚴格條件下與1)或2)或3)雜交且編碼具有相同功能蛋白的DM分子；
[0015] 5)與1)或2)或3)具有90%W上同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
[0016] 上述嚴格條件可為用0. 1 X SS陽（或0. 1 X SSC)，0. 1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實驗中65°C下雜交并洗膜。
[0017] 含有上述DNA分子的表達盒、重組載體、重組菌、轉基因細胞系或重組菌也是本發 明保護的范圍。
[0018] 上述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體得到的重組載體，在本發明的實施 例中，表達載體為PMDC32,重組載體為將序列表序列2自5'末端第10-1570位核巧酸插入 PMDC32載體的化nl和化cl位點間（即雙煙草花葉病毒啟動子35S下游）得到的載體，命 名為 35S: :GL3-3。
[0019] 上述重組菌為將所述重組載體導入目的菌中得到的重組菌，在本發明的實施例 中，目的菌為根癌農桿菌EHA105。
[0020] 上述的蛋白、上述DNA分子、含有上述DNA分子的表達盒、重組載體、重組菌、轉基 因細胞系或重組菌在調控植物產量中的應用也是本發明保護的范圍。
[0021] 上述應用中，所述產量通過巧粒粒長和/或粒重體現；
[0022] 所述調控植物產量為提高植物巧粒粒長和/或粒重；
[0023] 所述植物具體為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。
[0024] 本發明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。
[00巧]本發明提供的方法，為將上述DNA分子導入目的植物，得到轉基因植物；
[0026] 所述轉基因植物具有如下1)和/或2)特征：
[0027] 1)所述轉基因植物的巧粒粒長大于所述目的植物；
[0028] 2)所述轉基因植物的巧粒粒重大于所述目的植物；
[0029] 所述DNA分子通過權利要求4所述重組載體導入目的植物；
[0030] 所述植物具體為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。
[0031] 上述的蛋白、上述DNA分子、含有上述DNA分子的表達盒、重組載體、重組菌、轉基 因細胞系或重組菌在培育高產植物中的應用也是本發明保護的范圍；所述植物具體為單子 葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。 陽03引本發明的實驗證明，本發明克隆了正向調控水稻粒長和粒重的基因化3-3,將其導 入日本晴，得到轉基因水稻，轉基因水稻的粒長和/或粒重大于日本晴水稻，該基因為水稻 的高產優質育種提供了新的基因資源。
[0033] 本發明是運樣實現的：
[0034] 1、Q化掃描及定位：利用一個由水稻特大粒品種SLG-1 (供體親本，W下簡稱為 SLG)和小粒品種日本晴（Nipponbare，輪回親本，W下簡稱為Nip)構建的回交近交系 度ILs)群體在Ξ號染色體的末端標記M1278附近初步定位到一個控制巧粒長度和粒重的 QTL qGL3-3。利用在2013年北京中國農業大學上莊試驗站種植的約2000株近等基因系的 F2群體進行精細定化將目標基因定位在標記RM14484和RM1278之間約280化的區間內。
[0035] 2、候選區域的關聯分析與候選基因的確定：利用272份水稻微核屯、種質資源14X 的高精度測序獲得的候選區域極高密度的SNP數據（平均1化內有7個SNP)，對精細定位到 的候選區域進行關聯分析。在高度關聯的SNPs中，有19個集中分布在基因0s03g0183000 的啟動子區域。通過對該基因區域的序列比較分析，我們發現與日本晴相比，SLG中存在運 些SNP位點，因此，將0s03g0183000確定為候選基因（即GL3-3)。該基因的編碼產物具有 一個保守的AP2結構域，屬于AP2/EREBP家族。我們還發現在化3-3基因啟動子區域有很 多與植物生長發育相關的順式作用元件。
[0036] 3、GL3-3的單倍型分析：依據化3-3啟動子區域的5個最顯著的關聯位點（包含4 個SNP和一個indel)對本課題組捜集的水稻微核屯、種質中的247份材料進行單倍型分型 分析，它們可W被分成四種單倍型；根據系統發生分析，運四種單倍型又可W分成Class A 和Class B兩大類；其中，Class A的巧粒長度顯著長于Class B。
[0037] 4、GL3-3的功能驗證：利用超表達技術，通過農桿菌介導的遺傳轉化，發現該基因 表達量的升高能夠使轉化受體水稻"日本晴"的粒長從7. 22mm增長到7. 81mm ;千粒重從 21. 14g增加到23. 25g，達到極顯著的差異。
【附圖說明】
[0038] 圖1為水稻第Ξ染色體定位的分子標記示意圖
[0039] SSR 標記序列參見 ht1:p://www. gramene. org/。
[0040] 圖2為化3-3的單倍型分析結果圖
[0041] 圖3為根據系統發生分析得到的四種單倍型聚類分析結果示意圖。
[0042] 圖4為四種單倍型聚類分析得到的Class A和C