去甲萬古霉素衍生物及其制備純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物化學領域，具體而言，本發明設及去甲萬古霉素衍生物及其制備 純化方法。
【背景技術】
[0002] 去甲萬古霉素是一類糖膚類抗生素，在中國已經商業化應用近四十年，臨床主要 應用于治療屯、內膜炎、骨髓炎等嚴重感染性疾病。去甲萬古霉素主要對革蘭氏陽性菌有效， 特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌和耐青霉素的腸桿菌、肺炎 鏈球菌W及梭狀芽抱桿菌。去甲萬古霉素的產生菌為1959年李群等從貴州±壤中分離出的 放線菌萬-23號，后來命名為東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)。去甲萬古霉素 有著與另一個糖膚類化合物萬古霉素(VCM)基本類似的化學結構和生物活性，它們均由一 個Ξ環組成的屯膚母體和一個由葡萄糖-氨基糖組成的雙糖取代基，不同之處在于去甲萬 古霉素的N-末端較萬古霉素缺少一個N-甲基（圖1)。文獻中組成屯膚的氨基酸分別WAA-1 到AA-7表示，五個芳香環從A-E依次編號，另外，Ξ個大環的編號W芳香環編號組成A-B，C- 0-D和D-0-E，為了方便化合物結構解析，本申請將沿用文獻的編號方法。
[0003] 早期，萬古霉素初始使用階段，臨床使用過程中發現其引起多種負反應，如腎毒性 和耳毒性等，可能的原因是其純度低，雜質含量高的原因。隨后，人們使用高效液相色譜 化PLC)，毛細管電泳(CE似及液相質譜-質譜連用技術(LC-MS/MS)對萬古霉素有關物質進 行過系統深入的研究，從中發現了八個雜質分別是去氯萬古霉素 A和B，去雙氯萬古霉素，萬 古霉素過程降解產物CDP-Im和CDP-Im，去雙糖萬古霉素，去氨基糖萬古霉素和去甲萬古霉 素。進一步藥理活性實驗研究發現，含有CDP-Im和CDP-Im的萬古霉素藥品能引起臨床治療失 敗，而Ξ個去氯萬古霉素類似物的抗菌活性比萬古霉素降低了 2至10倍，去氨基糖的萬古霉 素的體內抗菌活性也大大降低，MIC約為萬古霉素的五倍。因此，《歐洲藥典》和《美國藥典》 將去氨基-，去雙糖基-，和去甲基萬古霉素定義為萬古霉素原料Ξ個主要雜質，并且規定其 單雜不得超過4%，總雜不得超過7%。
[0004] 相比而言，去甲萬古霉素由于其雜質成分不明確，因此，中國藥典規定W峰面積積 分計算，總雜不得超過12%，單雜少于4%。因此，需要更為有效的純化及鑒定去甲萬古霉素 的方法，同時，為了明確去甲萬古霉素原料藥中有關物質成分結構，還可W對去甲萬古霉素 原料藥進行更為系統的化學成分研究，發掘其新結構的結構類似物。
【發明內容】
[000引本發明從去甲萬古霉素原料藥中分離得到Ξ個糖膚類化合物，借助于1D，2D NMR 和HRESIMS等方法確定Ξ個化合物結構，均為去甲萬古霉素類似物，包括一個C-0-D開環和 兩個去糖基衍生物。
[0006]本發明首先設及一種去甲萬古霉素及其衍生物的HPLC制備分離方法，所述方法 為：
[0007] (1)流動相：甲醇:0.05~0.2 %甲酸水溶液，
[000引（2)梯度洗脫步驟:30~50min內甲醇從10%逐漸上升至70%，
[0009] (3)將去甲萬古霉素原料藥水溶液過色譜柱，流速為1.0~5.Oml/min，檢測波長 280nm，所述的去甲萬古霉素原料藥優選為去甲萬古霉素鹽酸鹽原料藥，
[0010] (4)收集主峰產物即得去甲萬古霉素純品，收集次峰產物即得去甲萬古霉素衍生 物。
[0011] 所述方法中，色譜柱優選為C18色譜柱或苯基柱。
[0012] 本發明還設及由所述方法分離獲得的去甲萬古霉素衍生物，所述的去甲萬古霉素 衍生物為:化合物1(結構如下式1所示）、化合物2或3(結構如下式2、3所示），
[0013]
[0014] R = 0-D-glucosyl，式2;
[0015] R = H，式 3
[0016] 本發明還設及所述化合物1-3在制備藥物中的應用，所述藥物為抗革蘭氏陽性菌 的藥物，所述的革蘭氏陽性菌優選為:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球 菌、耐青霉素的腸桿菌、肺炎鏈球菌W及梭狀芽抱桿菌。
【附圖說明】
[0017] 圖1化合物1-3,去甲萬古霉素和萬古霉素的結構，化合物1的HMBC相關用虛線彎箭 頭表不。
[0018] 圖2去甲萬古霉素原料藥的HPLC色譜分析圖。
[0019] 2A，使用《中國藥典》方法的冊L姻譜；
[0020] 2B，A圖中a，b，c和去甲萬古霉素的紫外圖譜疊加圖；
[0021 ] 2C，方法優化后HPLC圖譜；
[0022] 2D，C圖中雜質1，2,3,4和去甲萬古霉素的紫外圖譜疊加圖。
[0023] 圖3去甲萬古霉素(母離子為[M+扣Vz 1434,圖3A)和化合物1(母離子為[M+扣V Z1452，圖3C)的ESIMS/MS圖和兩者的裂解途徑(3B為去甲萬古霉素，3D為化合物1)。
【具體實施方式】
[0024] 去甲萬古霉素鹽酸鹽由華北制藥（中國河北石家莊市)提供；
[0025] 萬古霉素標準品購于中國食品藥品檢定研究院；
[0026] 色譜級乙臘和甲醇購于Adamas公司（中國上海）；
[0027] DMSO-ds由Cambridge Isotope公司生產（Cambridge ,ΜΑ,USA.);
[0028] 所有其它試劑（甲酸、憐酸、鹽酸、Ξ氣乙酸、氨水(含氨氣質量分數為25~28%)、 Ξ乙胺、四氨巧喃)均為化學級。
[0029] 使用的儀器，包括Ρ-2000旋光儀(JASC0，Tokyo Japan)，JASC0P-650紫外分光光度 計（JASC0)，SYS 600MHz核磁儀（Palo Alto,CA,USA)，Finnigan LTQ XT離子阱質譜儀 (Finnigan,San Jose,CA)，Finnigan LTQ軌道離子阱譜儀(Finnigan)，島津LC-20液相色譜 儀（Shim曰dzu,Jap曰η)D
[0030] 核磁測定方法：
[0031] 所有樣品的1h和1化NMR均在帶低溫探頭的SYS 600MHz核磁儀上測定，溶劑為気代 DMS0。1h和 1? NMR化學位移均使用TMS(δ = 0.0 Oppm)和DMSO-ds(δ = 39.5ppm)溶劑做內標。
[0032] 實施例1化合物1~3的制備與分離純化
[0033] 首先，我們使用了《中國藥典》中去甲萬古霉素原料藥HPLC方法來分析樣品（見圖 2A和2B)，發現在保留時間為21.44min的一個主峰，積分面積占所有峰面積總和的95.5%， 根據藥典中去甲萬古霉素出峰位置為18~22min，推測該物質就是去甲萬古霉素，另外，如 圖2A中所示，保留時間在該主峰前后還存在至少Ξ個積分面積較小的雜質峰，保留時間分 別為10.31(a) ,12.30(b) ,14.73(c)min，它們的在線紫外吸收峰型也與去甲萬古霉素相類 似，如圖2B所示。然而，由于該方法中使用了憐酸鹽，并且因為制備過程或者制備后樣品中 憐酸鹽的殘留會嚴重干擾質譜檢測，因此，運方法不適合對樣品進行液相色譜-質譜聯用 (LC-MS)。
[0034] 我們為了借助于LC-MS初步獲得運些衍生物雜質分子量等相應信息，建立了一套 流動相不含鹽的HPLC方法。當我們使用甲醇-0.1 %甲酸水溶液進行HPLC分析時候，發現相 應的主峰和雜質峰都能獲得很好的峰型，并且雜質與雜質之間，雜質與主峰之間也具有較 好的分離度，如圖2C所示，衍生物雜質1，2，3，4峰面積分別占總面積的3.4 %，1.91 %， 0.96%，和 2.02%，主峰為87.97%。
[00對 （1)優化的HPLC分析方法如下：
[0036] Agilent。8色譜柱（150X4.6mm i.d. ,5皿），
[0037] 流動相：甲醇:0.1 %甲酸水溶液，
[003引梯度洗脫步驟：（1)40111111內甲醇從10%逐漸上升至70%。
[0039] 1.0ml mirfi流速，280皿波長檢巧U，柱溫和檢測池溫度均為室溫(25°C)，3.Omg ml ^去甲萬古霉素原料藥水溶液，進樣量為20μ1。
[0040] (2)優化的HPLC制備方法如下：
[0041 ] YMC-化ck苯基柱（150X20mm i.d.，20ym，YMC Co.，1^(1，的〇扣，化9日11)，流動相配 置與梯度洗脫方法與分析實驗一致。
[0042] 流速為5.0ml min-i，單次洗脫時間為120min。
[0043] lOO