一種高純度雷帕霉素的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高純度雷帕霉素的制備方法。
【背景技術】
[0002] 雷帕霉素（Rapamycin，RPM，PAPA),又名西羅莫司（Sirolimus)，是 1975 年由加 拿大Ayerst研究所從吸水鏈霉菌（Strepomyces hygroscopicus)中分離出來的Η帰大 環內醋類抗生素。雷帕霉素的分子式為Cs化gN〇i3,分子量914,為白色固體結晶，烙點為 183-185°C，親脂性，溶解于甲醇、己醇、丙麗、氯仿等有機溶劑，極微溶于水，幾乎不溶于己 離。其結構式為：
西羅莫司具有異構體B和異構體C，其中異構體B為主要活性成分，上述結構式為異構 體B，異構體C結構式如下：
1977年發現其具有重要的免疫抑制作用，1989年開始把其作為用于抗器官移植排斥 反應的新型高效免疫抑制劑進行研究，1999年9月美國FDA批準其適用于在臨床上的腎移 植病人。在中國，西羅莫司口服液作為二類新藥2002年獲準進入國內臨床。2005年6月福 建省微生物研究所研制研發的國產西羅莫司經S抑A批準投放市場。現在西羅莫瓦器已成 功開發為新型強效的免疫抵制劑，用于器官移植搞排斥反應，用于治療自身免疫性疾病；用 于涂層支架，防止必臟血管再狹窄；作為mTOR祀向抗腫瘤藥物，抑制腫瘤的生長等 CN102433364B提供了一種微生物發酵法制取雷帕霉素的工藝，其中，包括W下步驟： 先在斜面培養基中培養吸水鏈霉菌，然后轉接于新鮮種子培養基中進行培養；將經所述種 子培養基培養的菌株按照2%的接種量接種至新鮮的發酵培養基中進行發酵培養，得到含 雷帕霉素的發酵液；將雷帕霉素發酵液加入娃藻±過濾，得到濕菌絲體，萃取、濃縮、結晶， 得到雷帕霉素粗品；然后再講雷帕霉素粗品經硅膠柱層析純化，最后重結晶得到雷帕霉素 終產品，純度在95% W上。
[0003] 專利CN101133065A公開了一種通過化學方法來純化雷帕霉素的方法。該方法純 化方法包括用Η甲基氯娃焼處理雷帕霉素得到31，42-雙-Η甲基甲娃基離，庚焼萃取，并 使31，42-雙-Η甲基甲娃焼離脫保護從而產生純化的雷帕霉素產物。該方法操做復雜，成 本較高，回收率低只能獲得98. 7%純度的雷帕霉素。
[0004] 專利CN 102464668 A公開了一種通過制備色譜純化得到高純度雷帕霉素的方法。 該方法用到了制備色譜，其設備、填料價格昂貴，生產成本高。
[0005] 專利CN 102070652 B公開了一種從發酵液中快速分離提取西羅莫司的方法，包括 將西羅莫司從發酵液中提取得到菌絲體，然后將菌絲體進行萃取、脫色得到粗提物，粗提物 通過高速逆流色譜分離，收集西羅莫司分離樣品溶液，濃縮干燥，得到成品，該方法具有提 取步驟簡單、節省溶劑等優點，但其采用高速逆流色譜分離，設備投入成本大，色譜上樣量 小（目前到克級)，不適合工業規模生產，并且經過該方法只能得到純度為90%的雷帕霉素產 品。
[0006] 專利CN102372726A公開了一種通過將西羅莫司菌絲體的浸提液進行吸附、萃取、 洗涂濃縮、洗涂、結晶、洗晶干燥等步驟，即可得到西羅莫司粗晶，該方法只能得到純度為 95%的雷帕霉素。
[0007] 雷帕霉素的發酵產量低，從發酵液中分離提取雷帕霉素的難度大，現有工藝均存 在分離效率低，能耗高，隨著雷帕霉素越來越多的進入臨床的使用，急需找到一種成本低、 操作簡單、高純度的制備方法。
【發明內容】
[0008] 為了解決上述技術問題，本發明提供了一種產品純度高，生產成本低的從發酵液 中分離純化雷帕霉素的方法，包括：從雷帕霉素發酵液中分離得到菌絲體，然后將菌絲體用 丙麗浸提，固液分離得到浸提液；將雷帕霉素浸提液采用下述步驟進行操作： (1 )、萃取、脫色：將浸提液濃縮后，用己酸己醋萃取，得到己酸己醋相；向己酸己醋相 加入活性炭脫色，無水硫酸鋼干燥； (2) 、硅膠柱層析；向步驟（1)干燥后的己酸己醋相中加入空白硅膠，濃縮成干粉，作為 上樣硅膠擊油離/己酸己醋作為洗脫劑，收集洗脫液，濃縮，得到粗品I ; (3) 大孔吸附樹脂吸附；將步驟（2)得到的粗品I用己臘水溶液溶解，通過大孔吸附樹 脂吸附，己臘水溶液作為解吸液，收集含雷帕霉素純度高的解吸液；將解吸液真空濃縮，然 后加入二氯甲焼萃取，合并二氯甲焼相，濃縮至干，得到粗品II ; (4) 結晶；將粗品II用己離溶解，4°C 攬拌結晶，過濾收集晶體，在常溫下真空干燥 得到純化的雷帕霉素。
[0009] 其中，從雷帕霉素發酵液中分離得到菌絲體所用方法可W為壓濾、抽濾或離必中 的一種或多種方式結合；浸提菌絲體所用丙麗的量約為菌絲體重量的：Γ4倍（v/w)。
[0010] 進一步的，所述步驟（1)萃取、脫色，優選將浸提液在5(TC下真空濃縮至幾乎不含 有丙麗，然后將濃縮液用：Γ4倍（￥；^88；^@旨/胖,&^胃51.；*)己酸己脂萃取，分離得到己酸己醋相；將 己酸己醋相用0. 5^5倍（V自胃弱堿性溶液洗涂：Γ5次，直到下層水溶液無明顯顏 色，所述所堿性溶液為質量濃度Ρ/Γ10%碳酸鋼、碳酸氨鋼、磯酸二氨鋼或磯酸二氨鋼的水 溶液；所述向己酸己醋相加入活性炭脫色，無水硫酸鋼干燥，優選向己酸己醋相加入活性炭 后，加熱到4(TC，脫色約30分鐘，過濾，己酸己醋層加入無水硫酸鋼干燥，過濾，收集己酸己 醋溶液；其中，活性炭的用量優選為0. 5%~10% (W活性炭/V己酸己J旨)，優選活性炭用量為1%-3% 活性炭/V己酸己醋)°
[0011] 進一步的，所述步驟（2)硅膠柱層析，優先將己酸己醋相中加入空白硅膠，然后 在小于5(TC下真空濃縮成干粉，作為上樣硅膠，所述空白硅膠為球形非鍵合硅膠，粒徑為 50-300目，用量為己酸己醋相中所含雷帕霉素質量的2^20倍，優選?Τ?Ο倍；裝柱完成后， 優選采用干法上樣；洗脫之前，優選先用石油離與己酸己醋的混合溶劑對硅膠柱進行梯度 預洗，所述預洗液石油離與己酸己醋體積比為2:8~5:5 ;該比例不是2:8~1:1范圍中的某一 個比例，而是梯度洗脫的溶劑比例在此范圍。所述預洗方法，例如可W是，在預洗過程中先 用2:8的石油離與己酸己醋預洗兩倍柱體積；然后用3:7的石油離與己酸己醋預洗兩倍柱 體積；再用4:6的石油離與己酸己醋預洗兩倍柱體積；再用5:5的石油離與己酸己醋預洗 兩倍柱體積，完成預洗。
[0012] 預洗完畢后，用石油離與己酸己醋的混合溶劑作為洗脫液對硅膠柱進行洗脫，，其 中，石油離與己酸己醋體積比為5: 5^3:7,最優選7:13洗脫完畢后收集洗脫液，將洗脫液在 溫度小于5(TC真空濃縮至干粉，得到雷帕霉素粗品I，純度為85% W上的雷帕霉素。
[0013] 進一步的，所述步驟（3)大孔吸附樹脂吸附，優選將粗品I用己臘水溶液溶解，然 后通過大孔樹脂吸附，其中，所述的己臘水溶液的濃度為40%~60%，優選50%，每克粗品I約 用40m廣60ml，優選50ml所述的己臘水溶液。例如，2g粗品I先加入50ml己臘，溶解后攬 拌下加入等量的純化水，攬拌均勻得到上柱液。所述大孔吸附樹脂為一種聚苯己帰二己帰 基苯形成的大孔樹脂，選自DIAI0N監20SS、化iPS40、監20SS和化iPS50組成的組，用量為 粗品II重量的100~500倍（W/V);更進一步的，優選大孔樹脂為化iPS40。
[0014] 吸附完畢后，用己臘水溶液作為洗脫液進行洗脫，優先洗脫液優選濃度為40%~70% 的己臘水溶液，更優選，洗脫液濃度為63%的己臘水溶液。收集純度較高組份，將純度較高 組份在低于4(TC下真空濃縮至己臘濃度低于10%后迅速降溫至4°C ^8°C。然后向濃縮液 中加入與濃縮液等體積的預先冷至4°C -8°C的二氯甲焼。攬拌30分鐘，分層收集二氯甲焼 層。
[0015] 向二氯甲焼層中加入無水硫酸鋼干燥，抽濾，將濾液在溫度低于45°C下真空濃縮 至干。得到雷帕霉素粗品II。
[0016] 進一步的，所述步驟（4)結晶，優先將粗品II用己離溶解，攬拌下緩慢降溫至 4Γ -8Γ攬拌結晶。過濾收集晶體，在25Γ下真空干燥得到純化的雷帕霉素，其中優選所用 己離體積為粗品II重量的5~15倍粗品II)，更優選為8-10倍粗品II);所述純 化的雷帕霉素 HPLC純度高于99%。
[0017] 所述HPLC檢測條件為：色譜柱；Kromasil C18柱；色譜柱規格；5 μ m， 4. 6mmX250mm ;流動相：體積比為甲醇：己臘：水=70:15:30的甲醇、己臘和水的混合溶 液；檢測波長：277皿；柱溫；40°C ;流速；Iml/min。
[0018] 本發明所用到的硅膠柱層析方法中，所用空白硅膠為一球形的非鍵和硅膠，其料 徑為50~300目，優選200~300目；硅膠柱的規格為：徑高比為1:5~1:15。優選1:8~1:10。 用量為雷帕霉素質量的50~150倍，最優選100~120倍。
[0019] 本發明提供的高純度的雷帕霉素制備方法是一種具有工業化生產價值的新工藝， 主要具有如下優點和積極效果： 第一，在制備的過程中，兩次柱層析都采用普通的常壓柱而沒有采用中壓制備色譜，從 而大大減少了生產的前期設備投入，有效的降低了生產成本； 第二，本發明采用采用柱層析結合大孔吸附樹脂的方法純化雷帕霉素原理簡單，操作 方便，對設備要求低，適合應用于工業化生產，柱層析采用石油離與己酸己醋的混合液做洗 脫液，相對現有技術中使用丙麗/己焼做洗脫液，分離效果好； 第H，本發明純化效率高，純化后得到的雷帕霉素 HPLC純度在99% W上； 第四，與現有技術相比，本發明不僅得到的產品的純度高，而且收率高。
【附圖說明】
[0020] 圖1顯示實施例1中所用發酵液的HPLC圖譜，雷帕霉素的保留時間約為4. 98min。 [002。 圖2顯示實施例1中己酸己醋經洗涂后的HPLC圖譜，雷帕霉素的保留時間約為 6. 38min。
[002引圖3顯示按實施例2所制得的粗品I的HPLC圖譜，雷帕霉素的保留時間約為 5. 37min。
[002引圖4顯示按實施例3所制的粗品II的HPLC圖譜，雷帕霉素的保留時間約