用于分析靶標的方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及用于分析靶標的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 近年來，已經嘗試使用包括與靶標特異性結合的結合核酸分子（所謂的"適體 (aptamer)"）在內的傳感器代替與靶標特異性結合的抗體進行靶標檢測。作為這樣的傳感 器，例如，已經報道了被配置為使得具有催化氧化還原反應能力的DNA(在下文中被稱為 "DNA酶"）與結合核酸分子連接從而檢驗靶標與結合核酸分子的結合的傳感器(非專利文獻 1)。在這種傳感器中，在不存在靶標的情況下發生結合核酸分子和DNA酶的自結合，由此抑 制了 DNA酶的催化能力(OFF)。另一方面，在靶標的存在下，自結合通過靶標與適體的接觸而 釋放，由此活化了DNA酶的催化能力(0N)。因此，如果靶標存在，其催化能力被活化的DNA酶 引起氧化還原反應，從而可以通過測量反應來間接地分析靶標。
[0003] 然而，取決于存在或不存在靶標，上述傳感器需要對在傳感器中使用的DNA酶的催 化能力的0N-0FF控制。此外，為了進一步提高在使用傳感器的分析中的分析靈敏度，例如， 需要使用展現出更強催化能力的DNA酶。
[0004] 使用結合核酸分子（適體）的ELAA(酶聯適體測定（Enzyme-1 inked Aptamer Assay))是例如使用以生物素標記的結合核酸分子的方法。在這種方法中，與鏈霉抗生物素 蛋白融合的酶，如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，與生物素標記的核酸分子結合，并且通過 檢測酶的底物來分析靶標與結合核酸分子的結合。然而，在ELAA中，結合核酸分子的標記是 必需的，并且為了提高分析靈敏度，例如需要改善各種條件設置。
[0005] 如上所述，在使用上述傳感器的情況下，需要使各種改進從而進行更可靠的分析。
[0006] 這些情況下，存在對能夠使用結合核酸分子容易地檢測靶標并且還能夠容易地提 高分析靈敏度的方法的需求。
[0007] 引用清單
[0008] 非專利文獻
[0009] [非專利文獻 1 ]Carsten Teller等人，Anal · Chem. 2009，81，pp · 9114-9119 [0010] 發明概述
[0011] 本發明要解決的問題
[0012] 考慮到前述內容，本發明的目的是提供可以使用結合核酸分子容易地分析靶標的 新方法以及用于在該方法中使用的分析試劑盒。
[0013]解決問題的手段
[0014]本發明提供用于分析靶標的分析方法，其包括:使得與所述靶標結合的結合核酸 分子與樣品彼此接觸以形成所述結合核酸分子與所述樣品中所述靶標的復合物的復合物 形成步驟;通過核酸酶處理將核酸單體從復合物級分和非復合物級分中的至少一個釋放的 核酸酶處理步驟;使釋放的核酸單體與以所述核酸單體為底物的酶進行反應的酶處理步 驟;檢測所述酶反應的檢測步驟;和根據檢測所述酶反應的結果分析已經形成了所述復合 物的所述靶標的分析步驟。
[0015] 本發明還提供用于在根據本發明的分析方法中使用的分析試劑盒，其包括:與靶 標結合的結合核酸分子;核酸酶;和以核酸單體為底物的酶。
[0016] 本發明的效果
[0017] 根據本發明的分析方法，可以通過下列方式容易地檢測靶標:形成靶標和結合核 酸分子的復合物，將核酸單體從復合物級分或非復合物級分釋放，以及進行與作為底物的 釋放的核酸單體的酶反應。根據這種方法，例如，不必如上文所述的那樣使DNA酶與適體連 接，從而取決于存在或不存在靶標的對DNA酶的催化能力的0N-0FF控制也不是必需的。此 外，根據本發明的分析試劑盒，能夠容易地進行本發明的分析方法。因為本發明涉及使用適 體的靶標檢測方法，可以認為，例如，本發明是用于各種領域（如臨床醫療實踐、食品和環 境)中的研究和試驗的非常有用的技術。
[0018] 附圖簡述
[0019] [圖1]圖1是示出本發明的分析方法的一個實例的示意圖。
[0020] [圖2]圖2是示出本發明的分析方法的另一個實例的示意圖。
[0021] [圖3]圖3是示出本發明的分析方法的又一個實例的示意圖。
[0022] [圖4]圖4是示出本發明的分析方法的此外另一個實例的示意圖。
[0023][圖5]圖5是顯示實施例1中發光量的圖表。
[0024][圖6]圖6是顯示實施例2中發光量的圖表。
[0025][圖7]圖7是顯示實施例3中發光量的圖表。
[0026][用于實施本發明的方式]
[0027] 如上所述，本發明的分析方法是用于分析靶標的分析方法，其包括:使得與所述靶 標結合的結合核酸分子與樣品彼此接觸以形成所述結合核酸分子與所述樣品中所述靶標 的復合物的復合物形成步驟;通過核酸酶處理將核酸單體從復合物級分和非復合物級分中 的至少一個釋放的核酸酶處理步驟;使釋放的核酸單體與以所述核酸單體為底物的酶進行 反應的酶處理步驟;檢測所述酶反應的檢測步驟;和根據檢測所述酶反應的結果分析已經 形成了所述復合物的所述靶標的分析步驟。
[0028] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，其還包括，在所述復合物形成步驟之 后的將所述復合物級分和所述非復合物級分與用于所述復合物形成的反應體系分離的分 離步驟。
[0029] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述分離步驟中，通過使得用于所 述復合物形成的所述反應體系與固定的結合物質彼此接觸以將所述復合物與所述結合物 質結合，而將所述復合物級分和所述非復合物級分分離，并且所述結合物質是與靶標結合 的結合物質。
[0030] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述分離步驟中，在所述復合物已 經與所述結合物質結合之后，洗滌所述固定的結合物質以移除未反應的結合核酸分子。 [0031 ]本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述核酸酶處理步驟中，對所述復 合物級分進行所述核酸酶處理將所述核酸單體從所述復合物釋放。
[0032]本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述核酸酶處理步驟中，對所述非 復合物級分進行所述核酸酶處理將所述核酸單體從未反應的結合核酸分子釋放。
[0033] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述結合核酸分子包含添加到其上 的多核苷酸，并且所述多核苷酸包含作為所述酶的底物的核酸單體。
[0034] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述結合核酸分子負載在載體上。
[0035] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述載體還包含添加到其上的多核 苷酸，并且所述多核苷酸包含作為所述酶的底物的核酸單體。
[0036] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述核酸酶處理步驟中，對所述復 合物形成步驟中的反應體系進行所述核酸酶處理以將所述核酸單體從未反應的結合核酸 分子釋放。
[0037] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述結合核酸分子是與單鏈核酸分 子的雜交體的形式，所述單鏈核酸分子包含與所述結合核酸分子互補的序列；在所述復合 物形成步驟中，使得所述雜交體和所述樣品彼此接觸以形成在所述雜交體中的所述結合核 酸分子與所述靶標的復合物并且將所述單鏈核酸分子從所述雜交體釋放;并且在所述核酸 酶處理步驟中，對所述復合物形成步驟中的反應體系進行所述核酸酶處理以將所述核酸單 體從所述釋放的單鏈核酸分子釋放。
[0038] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述結合核酸分子負載在載體上并 且是與單鏈核酸分子的雜交體的形式，所述單鏈核酸分子包含與所述結合核酸分子互補的 序列；在所述復合物形成步驟中，使得所述雜交體和所述樣品彼此接觸以形成在所述雜交 體中的所述結合核酸分子與所述靶標的復合物并且將所述單鏈核酸分子從所述雜交體釋 放;并且在所述核酸酶處理步驟中，對所述復合物形成步驟中的反應體系進行所述核酸酶 處理以將所述核酸單體從所述釋放的單鏈核酸分子釋放。
[0039] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，其還包括，在所述復合物形成步驟之 后的將所述釋放的單鏈核酸分子與所述復合物形成步驟中的反應體系分離的分離步驟，并 且在所述核酸酶處理步驟中，對所述分離的單鏈核酸分子進行所述核酸酶處理以將所述核 酸單體從所述單鏈核酸分子釋放。
[0040] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述核酸酶是以所述單鏈核酸分子 為底物的核酸酶。
[0041 ]本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述核酸酶是核酸外切酶。
[0042]本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，作為所述酶的底物的所述核酸單體 是腺苷核苷酸，其可以是，例如，核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸中的至少一種。
[0043]本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述酶是具有熒光素酶活性的蛋白 質，并且其具體實例是熒光素酶。
[0044] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述酶處理步驟中，所述酶反應在 試劑的存在下進行，并且
[0045] 所述試劑是使得信號通過與以所述核酸單體為底物的酶反應而產生的試劑，或者 是使得信號通過與以所述核酸單體為底物的酶反應而消失的試劑。
[0046] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述檢測步驟中，檢測到通過所述 酶反應產生的信號或通過所述酶反應導致消失的信號。
[0047] 本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述信號是光信號和電信號中的至 少一種。
[0048]本發明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述載體是珠或平板。
[0049]本發明的分析試劑盒是，例如，用于在根據本發明的分析方法中使用的分析試劑 盒，其包括:與靶標結合的結合核酸分子;核酸酶;和以核酸單體為底物的酶。
[0050] 本發明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述結合核酸分子包含添加到其 上的多核苷酸，并且所述多核苷酸包含作為所述酶的底物的核酸單體。
[0051] 本發明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述結合核酸分子負載在載體上。
[0052] 本發明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述載體還包含添加到其上的多 核苷酸，并且所述多核苷酸包含作為所述酶的底物的核酸單體。
[0053]本發明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述結合核酸分子是與單鏈核酸 分子的雜交體的形式，所述單鏈核酸分子包含與所述結合核酸分子互補的序列，并且通過 與所述靶標接觸，所述雜交體中的所述結合核酸分子與所述靶標形成復合物并且釋放所述