用于預防和治療用途的作為免疫刺激劑的基于球形核酸的構建體的制作方法

用于預防和治療用途的作為免疫刺激劑的基于球形核酸的構建體的制作方法
【專利說明】用于預防和治療用途的作為免疫刺激劑的基于球形核酸的構 建體
[0001 ] 相關申請
[0002] 本申請根據35U.S.C.§119(e)要求2013年7月25日提交的題為"作為用于預防和治 療用途的免疫刺激劑的基于球形核酸的構建體"的美國臨時申請號61/858,558的優先權， 通過引用將其全文并入本文中。 發明領域
[0003] 本發明涉及核酸相互作用復合物的激動劑例如TLR的激動劑的納米級構建體及其 方法和組合物。
[0004] 發明背景
[0005] 免疫系統是高度發展，非常精確的內源性機制，其用于清除包括病原體和衰老或 惡性宿主細胞的異質的、有害的和不必要的物質。已知的是，可以通過引入調節特異性免疫 細胞的活性的化合物，實現調節用于治療或預防目的的免疫系統。一個主要的例子是疫苗， 其已顯示誘導針對病原體以及癌細胞的保護的能力。第一個現代疫苗制劑包括活/減毒或 滅活的病原體，但在許多情況下這些疫苗制劑被認為毒性太大，或沒有提供保護性免疫。純 化的蛋白衍生物和其它抗原亞單位疫苗的策略被一直研究，但這些通常導致輕度保護性或 低效率的響應。現在所理解的是，在大多數情況下，公知有效免疫需要使用免疫刺激化合 物，除其他事項外，免疫刺激化合物提供必要的信號，以誘導更加穩健的，特異性和長時間 的應答，包括細胞介導的免疫和免疫記憶。這些應答的性質可以通過引入的免疫刺激性一 個或多個化合物的類型來調節。實際上，已經假定，在適當的抗原刺激的存在下一起施用的 免疫刺激性化合物可用于誘發多種免疫應答，這具有治療或預防各種疾病，包括感染性疾 病和癌癥的可能性。這些也可能會被用于接種免疫功能低下的人群，如兒童和老人。 1
[0006] 在各種具有關鍵全世界影響的，包括艾滋病(AIDS)，瘧疾，衣原體，各種惡性腫瘤 和變態反應或變應性疾病，如哮喘的疾病中，現有疫苗不能誘導有效的免疫應答。在處于開 發中的免疫刺激化合物中，To 11樣受體(TLR)激動劑已經被證明具有優秀潛力。TLR4激動 劑，諸如單磷酰脂質A(MPL)已經達到臨床試驗的后期和在一些情況中在多個國家中得到批 準。 2盡管有這些令人鼓舞的結果，仍然對可以安全和有效地誘導應答的化合物有明確和顯 著的需要，所述應答可以清除細胞內病原體和癌癥，例如細胞介導的免疫誘導劑。TLR 3， TLR7/8和TLR 9的激動劑由于其誘導Thl細胞介導的免疫應答的強效能力，具有優異的潛 力。合成TLR 7/8激動劑，咪喹莫特，已經被批準用于治療各種皮膚疾病，包括表淺性癌和生 殖器疣，并正在針對各種其他適應癥而被開發。同樣，TLR 9激動劑處于臨床開發的各個階 段，用于治療各種疾病，所述疾病伴有大量未滿足的醫療需求。然而，由于缺乏療效，脫靶硫 代磷酸酯的影響和毒性問題減緩TLR 7/8和9激動劑的有效的臨床平移。
[0007] 發明概述
[0008] 本文中所述的是，用于使用納米級構建體、增強免疫應答并活化核酸相互作用的 復合物(諸如TLR)的新方法和組合物。本發明的方面涉及納米級構建體，其具有核酸相互作 用復合物的激動劑的冠部，其中核酸相互作用復合物的激動劑的表面密度為至少〇.3pmol/ cm2。
[0009] 在其他方面，本發明是構建體，其具有核酸相互作用復合物的拮抗劑的冠部，以及 被并入冠部的抗原。在一些實施方案中，抗原的表面密度為至少〇.3pmol/cm 2。在其他實施 方案中，抗原包括至少兩種不同類型的抗原。
[0010] 在又一些其他方面，本發明是構建體，其具有并入了核酸相互作用復合物的至少 兩種激動劑的冠部，其中激動劑選自由TLR 3、7/8和/或9的激動劑組成的組。
[0011] 在一些實施方案中，核酸相互作用復合物的激動劑含有間隔子。
[0012] 在其他實施方案中，核酸相互作用復合物的激動劑是RNA或DNA。核酸相互作用復 合物的激動劑可以是例如雙鏈RNA，如聚（I:C)。備選地，核酸相互作用復合物的激動劑可以 是單鏈RNA，如含UUG-基序的RNA。在一些實施方案中，核酸相互作用復合物的激動劑為未甲 基化的脫氧核糖核酸，諸如CpG寡核苷酸。
[0013] 在某些實施方案中，納米級構建體包括在冠部中心的納米顆粒核心并且任選地納 米顆粒核心是金屬的。金屬核心選自由金、銀、鉑、鋁、鈀、銅、鈷、銦、鎳及其混合物組成的 組。在某些實施方案中，納米顆粒核心包含金。在其他實施方案中，納米級構建體是可降解 的。
[0014] 在某些實施方案中，納米級構建體的直徑是平均直徑lnm至大約250nm、平均直徑 大約lnm至大約240nm、平均直徑大約lnm至大約230nm、平均直徑大約lnm至大約220nm、平均 直徑大約lnm至大約210nm、平均直徑大約lnm至大約200nm、平均直徑大約lnm至大約190nm、 平均直徑大約lnm至大約180nm、平均直徑大約lnm至大約170nm、平均直徑大約lnm至大約 160nm、平均直徑大約lnm至大約150nm、平均直徑大約lnm至大約140nm、平均直徑大約lnm至 大約130nm、平均直徑大約lnm至大約120nm、平均直徑大約lnm至大約llOnm、平均直徑大約 lnm至大約lOOnm、平均直徑大約lnm至大約90nm、平均直徑大約lnm至大約80nm、平均直徑大 約lnm至大約70nm、平均直徑大約lnm至大約60nm、平均直徑大約lnm至大約50nm、平均直徑 大約lnm至大約40nm、平均直徑大約lnm至大約30nm或者平均直徑大約lnm至大約20nm或者 平均直徑大約lnm至大約10nm。
[0015]在其他方面，本發明是納米級構建體，其具有核酸相互作用復合物的激動劑的冠 部，其中激動劑是具有至少一個核苷酸間磷酸二酯鍵的核酸。在一些實施方案中，所述激動 劑是CpG寡核苷酸。在其它實施方案中，核酸的每個核苷酸間鍵是磷酸二酯鍵。
[0016] 在本發明的實施方案中，冠部是球形冠部。
[0017] 根據本發明的其他方面，提供了由如本文中所述的納米級構建體和載體組成的疫 苗。
[0018] 在其他方面中提供了用于向細胞遞送治療劑的方法，其包括向細胞遞送本發明的 納米級構建體。
[0019] 在本發明的其他方面中提供了用于調控靶分子的表達的方法。該方法涉及向細胞 遞送本發明的納米級構建體。在一些實施方案中，靶分子是選自由TLR3、7、8和9組成的組的 TLR〇
[0020] 在本發明的其他方面中提供了用于活化TLR的方法，其通過向細胞遞送如本文中 所述的納米級構建體。
[0021] 根據其他方面，本發明是治療受試者的方法，其涉及向受試者施用有效量的如本 文中所述的納米級構建體以刺激免疫應答。在一些實施方案中，受試者患有感染性疾病、癌 癥、自身免疫性疾病、變態反應或變應性疾病，如哮喘。
[0022] 在依然其他實施方案中，本發明是誘導受試者中免疫應答的方法，其通過向受試 者施用有效量的核酸相互作用復合物的激動劑的冠部的納米級構建體以刺激免疫應答，其 中所述激動劑是具有至少一個核苷酸間磷酸二酯鍵的核酸。
[0023] 在某些實施方案中，該方法涉及向細胞遞送治療或檢測形式(modality)。
[0024] 本發明進一步的方面涉及試劑盒，其包含:納米級構建體，其任選包括納米顆粒核 心;并且具有核酸相互作用復合物的激動劑和用于組裝核酸相互作用復合物的激動劑-冠 部的說明。在某些實施方案中，該試劑盒進一步包含使用說明。
[0025] 本發明的每個限制可以涵蓋本發明的各種實施方案。因此，預計涉及任一種元素 或元素的組合的本發明的每個限制可以被包括于本發明的每個方面。本發明不限于所應用 的以下說明中所列出的或附圖中所示的成分的構建和排列的細節。本發明能夠具有其他實 施方案并以各種方式進行實踐或執行。
【附圖說明】
[0026]附圖并不旨在按比例繪制。在附圖中，在各個圖中示出的每個相同或近似相同的 成分由相同的標號表示。為了清晰起見，在每幅圖中并非每個成分均可被標記。在附圖中：
[0027] 圖1A-1B顯示本發明的納米級構建體的示意的非限制性實例。A.示出的是佐劑納 米級構建體的一般結構，所述納米級構建體具有核心以及與核心結合的一種或多種核酸相 互作用復合物的激動劑，如TLR激動劑。B.示出的是佐劑納米級構建體的一般結構，所述納 米級構建體具有核心和與核心結合的一種或多種TLR激動劑和一種或多種抗原。
[0028] 圖2是一組曲線圖，其描繪本發明納米級構建體相對于在溶液中的核酸相互作用 復合物(CpG寡核苷酸)的激動劑在巨噬細胞中顯著增強的效力。
[0029] 圖3是一組曲線圖，其描繪在過夜孵育后本發明納米級構建體相對于在溶液中的 核酸相互作用復合物(CpG寡核苷酸)的激動劑在巨噬細胞中顯著增強的效力。
[0030] 圖4是一組曲線圖，其描繪采用本發明納米級構建體相對于在溶液中的核酸相互 作用復合物(CpG寡核苷酸）的激動劑的細胞因子分泌增強水平。針對在納米級構建體和TRL 激動劑組中均具有磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷酸間鍵的寡核苷酸，檢驗了對細胞因子誘導 的影響。
[0031] 圖5是線圖和柱狀圖，其描繪響應于刺激的TLR9活化，所述刺激采用具有磷酸二酯 CpG的寡核苷酸的本發明的納米級構建體，與溶液中的磷酸二酯和硫代磷酸酯CpG寡核苷酸 比較。
[0032] 圖6是一組曲線圖，其描繪本發明的納米級構建體相對于幾個不同的CpG寡核苷酸 序列在效力中的多倍增加 。CpG 1826是SEQ ID N0:1和它下面的rplV是SEQ ID N0:2<XpG 1668為SEQIDN0:3和其下面的rplV是SEQIDN0:4。
[0033] 圖7是一組曲線圖，其描繪調節對激動劑活性的增強的納米級構建體核心大小暗 示的效果。
[0034] 圖8示出曲線圖，其描繪比CpG寡核苷酸更快速和持續的活化。
[0035] 圖9是一組曲線圖，其描繪硫代磷酸酯修飾以序列依賴性的方式調節激動劑活性 的能力。對于CpG 1668:P0是SEQ ID N0:5，C*G是SEQ ID N0:6,5PS2/C*G是SEQ ID N0:7,和 PS是SEQIDNO:8。對于CpG 1826:PO是SEQIDNO:9,OG是SEQIDNO:10,5PS2/OG是SEQ ID NO:11，和PS是SEQ ID NO:12。
[0036] 圖10是一組曲線圖，其描繪寡核苷酸負荷密度影響激動劑活性的能力。
[0037]圖11示出曲線圖，其描繪CpG Ρ0/Ρ0納米級構建體的活化的時間過程。在孵育>4小 時前不會活化測試的構建體。
[0038]圖12示出曲線圖，其表明5'Chol CpG P0納米級構建體顯示在低nM范圍的活化，并 且5'C18廢除活性。
[0039] 圖13是一組曲線圖，其表明對于隨后的活化，預鋪板的巨噬細胞是更主要的。
[0040] 圖14是一組曲線圖，其表明由巨噬細胞導致低水平的IFN- γ分泌。
[0041 ]圖15示出了免疫治療的SNA (AST-008)的表示。圖6示出了，SNAS可以使治療性疫苗 抗原和佐劑同時存在于單一的納米顆粒，并可能同時靶向多個免疫刺激受體(例如TLR 3， 4,7/8,9)〇
[0042]圖16是一個簡圖，其表明AST-008如何可以通過觸發胞吞作用進入內體，然后AST-008 在內體中可以用于通用的免疫系統刺激。在內體中， AST-008 通過 TLR 9 受體、 SNA 療法的 分子靶標，刺激免疫系統信號傳導，導致先天性和適應性免疫應答。AST-008也可以靶向TLR 3，4 7/8,導致先天和適應性免疫應答。
[0043]圖17A和17B是一組曲線圖，其示出了，與體外相應的CpG寡脫氧核苷酸(〇1 igo)相 比，AST-008誘導更高的促炎性應答。圖17A示出了由CTL oligo，CTL SNA，CpG 1826,和AST-008誘導的TNF，IL-12，和IL-6的表達水平。圖17B展示了從所示的試劑所產生的NF-κΒ活化。 [0044]圖18表明，單一皮下劑量的施用后，AST-008靶向引流淋巴結。AST-008被銀染色以 增強金核心的光散射，然后用曙紅復染。使用4X亮視野放大倍率。
[0045]圖19是說明A S T - 0 0 8的體內活性的曲線圖。小鼠被給予5.1納摩爾（n m ο 1)溶液 (AST-008-po，AST-008-ps，CpG 1826-po，CpG 1826-ps，GpC-po SNA，GpC-ps SNA，GpC-po， 或GpC-ps)的50yL推注尾靜脈(靜脈內）注射，然后在注射后1，3和6小時分析IL-12表達(每 組24只小鼠，每個時間點3只）<JL-12水平被表示為相對于PBS的倍數。相對于游離寡聚脫氧 核苷酸，AST-008結構增強IL-12的誘導大約20倍，和初始給藥后六小時期間效果得以持續。 [0046] 圖20A-20C由一對圖形和圖表組成，所述圖形和圖表顯示，AST-008誘導平衡的 Thl/Th2應答（圖20A)和比明礬或CpG寡核苷酸更高的IgG2a抗體（圖20B)的應答。結果被制 表于圖 20(λ#ρ〈0·01。
[0047] 圖21Α-21Β顯示，AST-008比明礬或CpG寡核苷酸更有效地誘導細胞應答。圖21Α示 意性地表示方案:使脾細胞生長28天，在第0天與第21天對其進行攻擊，然后采用SIINFEKL 進行再刺激和用ELISP0T在第28天探查INF-□。圖21B是描繪結果的圖。##p〈0.0001。 [0048] 圖22A-22B表明，AST-008在體內淋巴瘤模型中誘導顯著腫瘤清除免疫應答。圖22A 示出方案:C57BL/6小鼠的右側肋被注射1 X 106E. G7-0VA淋巴瘤(每組11個）。然后采用100 微克(yg)〇VA皮下（s · c ·)，1 ·8微克OVA 257-264皮下和AST-008中的0 ·92納摩爾(nmol )oligo 對小鼠進行三次攻擊，并且以2000立方毫米處死小鼠。圖22B是結果的曲線圖。*p〈0.05，使 用雙因素 AN0VA。
[0049] 圖23A-23B顯示，與CpG寡脫氧核苷酸相比，AST-008表現出更優異的抗腫瘤活性和 更長的生存。這些圖顯示，在C57BL/6小鼠在其右側肋(每組11只）被注射1 X 106E. G7-0VA淋 巴瘤、然后用TOS，PBS和0VA，CpG 1826和0VA，或AST-008和0VA攻擊三次后，腫瘤體積（圖 23A)和存活百分比（圖238)。噸〈0.05。
[0050] 登述
[0051] 本發明不限于所應用的以下說明中所列出的或附圖中所示的成分的構建和排列 的細節。本發明能夠具有其他實施方案并以各種方式進行實踐或執行。此外，本文中使用的 措辭和術語是為了說明的目的，而不應被視為限制。本文中使用"包括"、"包含"或"具有"、 "含有"、"涉及"及其變型是指涵蓋其后所列出的項目及其等價物以及其他項目。
[0052] 在一些方面，本發明尤其通過實現更快的活化，產生多價結構，改變細胞分布，并 促進各種佐劑和含有抗原的結構的簡單且可擴大規模的合成，克服了常規的TLR 3，TLR 7/ 8,和TLR 9激動劑所遇到的幾個主要障礙。本發明的構建體導致用于在治療多種疾病/感染 中的預防或治療用途中的更有效的疫苗，所述疾病/感染包括，例如，艾滋病(AIDS)，瘧疾， 衣原體，彎曲桿菌，巨細胞病毒，登革熱，EB單核細胞增多(Epstein-Barr mononucleosis)， 口蹄疫(foot and mouth disease)，狂犬病，幽門螺桿菌胃潰瘍，甲、乙、丙型肝炎，單純皰 疹，流感，利什曼病，霍亂，白喉，嗜血桿菌流感，腦膜炎球菌性腦膜炎，鼠疫，肺炎球菌性肺 炎，破傷風，傷寒，呼吸道合胞病毒，鼻病毒，血吸蟲病，志賀氏菌，A和B族鏈球菌，結核病，霍 亂弧菌，沙門氏菌，曲霉菌，芽生菌，組織胞漿菌，念珠菌，隱球菌，肺囊蟲和泌尿道感染;各 種食物變態反應，如花生，水果，大蒜，燕麥，肉，奶，魚類，貝類，大豆，堅果，小麥，面筋(谷蛋 白、麩質），蛋，亞硫酸鹽;各種藥物變態反應，如對以下的變態反應：四環素，苯妥英鈉，卡馬 西平，青霉素類，頭孢菌素類，磺胺類，NSAIDs的，靜脈內造影劑，局部麻醉劑；自身免疫疾病 如多發性硬化癥，狼瘡，炎性腸病，克羅恩氏病，潰瘍性結腸炎，哮喘，和慢性阻塞性肺病 (C0PD);和癌癥，如黑色素瘤，乳腺癌，前列腺癌，膀胱癌，非小細胞肺癌(NSCLC)，多形性膠 質母細胞瘤等。
[0053] 在示意圖1中示出，一組本發明的示例性納米構建體。在此描述的平臺是用于裝載 核酸相互作用復合物的一種或多種激動劑(multiple agonist)(A)或核酸相互作用復合物 的一種或多種激動劑和抗原(B)。（ 1)核酸相互作用復合物，如被靶向的TLR(TLR3，7/8，和/ 或9)，（2)核酸相互作用復合物的激動劑的密度，（3)抗原密度，（4)多個抗原呈遞，（5)核心 構成，大小和電荷，和(6)核心接頭化學"L"，和(7)激動劑化學結構的優化被預計在疫苗開 發中得到新的范例。特別是，核酸相互作用復合物的激動劑包括雙鏈RNA(如聚（I:C