包含小分子化合物的用于維持多能干細胞染色體穩定性的組合物的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于維持多能干細胞的染色體穩定性的組合物，其包含小分子化合物，且更具體地，涉及用于維持誘導的多能干細胞的染色體穩定性的組合物，其包含能夠在誘導的多能干細胞的誘導和所述細胞后續培養過程中抑制染色體結構和數目突變或DNA損傷的ROCK抑制劑、MEK抑制劑、ALK5抑制劑或抗氧化劑。
技術背景
[0002]用于產生誘導的多能干細胞的技術是使用動物體細胞制備與胚胎干細胞相似的細胞的技術，且包括在特定培養條件下于四種已知的重編程因子(0ct4、Klf4、Sox2和cMyc)存在下培養細胞。通過該方法制備的誘導的多能干細胞具有分化成為所有組織特異性細胞的優勢，并可用作不構成任何倫理問題的細胞治療劑，但這些誘導的多能干細胞具有的劣勢在于它們以低效率產生，它們的安全性難以保證且與胚胎干細胞并不完全相似。
[0003]自2006誘導的多能干細胞技術開發以來，已實施對于該技術的許多研究，且由這些研究獲得的多種組合物已用于增加產生誘導的多能干細胞的效率。作為結果，23篇文章已報道使用特定的組合物成功增加誘導的多能干細胞的產生效率，且6篇文章已報道即使在一種或多種重編程因子不存在下也可成功產生誘導的多能干細胞。
[0004]至今，已實施研究來主要增加產生誘導的多能干細胞的效率。然而，當僅誘導的多能干細胞的產生效率增加而誘導的多能干細胞的安全性確認不足時，看起來誘導的多能干細胞并非是臨床上可應用的。因此，為增加誘導的多能干細胞的臨床應用性，需要致力于增加誘導的多能干細胞安全性的研究，且應該開發制備與胚胎干細胞更相似的誘導的多能干細胞的方法。
[0005]在與本發明相關的現有技術中，韓國專利注冊號10-1211610(2012年12月6日)公開了通過使用Bmil、MEK抑制劑和GSK抑制劑誘導從體細胞至胚胎干細胞樣細胞的反分化(dedifferentiat1n)的組合物，和使用所述組合物用于產生胚胎干細胞樣細胞的方法。韓國專利注冊號10-1211624(2012年12月6日)公開了通過使用Shh、FGFR酪氨酸激酶抑制劑、MEK抑制劑和GSK抑制劑誘導從體細胞至胚胎干細胞樣細胞的反分化的組合物，和使用所述組合物用于產生胚胎干細胞樣細胞的方法。此外，韓國專利公開號10-2010-0101764(2010年9月20日)、韓國專利公開號10-2011-0094348(2011年8月23日)、韓國專利公開號10-2012-0094488(2012年8月24日)和韓國專利公開號10-2012-0121084(2012年11月5日)公開了用于產生和維持多能干細胞的有用培養方法和培養基等。
[0006]與本發明的領域相關的數篇文章已報導使用組合物處理增加誘導的多能干細胞產生的效率，但此使用組合物的處理是否可抑制誘導的多能干細胞的突變尚不知曉。具體地，未報導包含MEK抑制劑、ALK5抑制劑、ROCK抑制劑或抗氧化劑的組合物的使用可抑制突變或DNA損傷，后者為在誘導的多能干細胞產生中發生的問題，因而可提供穩定的誘導的多能干細胞。
[0007]因此，本發明發現了包含ROCK抑制劑thiazovivin、MEK抑制劑TO0325901、ALK5抑制劑SB431542或抗氧化劑L-抗壞血酸的組合物通過抑制誘導的多能干細胞中的結構突變和數目突變或DNA損傷維持染色體穩定性，由此完成本發明。
[0008]現有技術文獻
[0009]專利文件
[0010]專利文件1:韓國專利注冊號10-1211610(2012年12月6日)
[0011 ] 專利文件2:韓國專利注冊號10-1211624(2012年12月6日)
[0012]專利文件3:韓國專利公開號(2010年9月20日)
[0013]專利文件4:韓國專利公開號10-2011-0094348(2011年8月23日)
[0014]專利文件5:韓國專利公開號10-2012-0094488(2012年8月24日)
[0015]專利文件6:韓國專利公開號10-2012-0121084(2012年11月5日)
[0016]非專利文件
[0017]非專利文件1: Li, W.,Vei,V.,Zhu,S.,ZhuJ.，Shi，Y.,Lin,T.,Hao,E.,Hayek1A.，Deng，H.，和Ding,S.(2009a).Generat1n of rat and human induced pluripotent stemcells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.Cell StemCell 4,16-19.
[0018]非專利文件2: Li，W.，Zhou，Η.,Abujarour，R.，Zhu, S.,Young Joo , J.,Lin,T.,Hao,E.,Scholer,H.R.,Hayek，A.和Ding,S.(2009b).Generat1n of human-1nducedpluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2.Stem Cells 27,2992—3000.
[0019]Non-專利文件3: Lin，T., Ambasudhan , R., Yuan , X.,Li , ff.，Hilcove，S.,Abujarour，R.，Lin，X.，Hahm，H.S.，Hao，E.，Hayek，A.等(2009).A chemical platform forimproved induct1n of human iPSCs.Nat Methods 6,805-808.
[0020]Non-專利文件 4:Yuan，X.,ffan,H.，Zhao，X.，Zhu，S.，Zhou，Q.和Ding，S.(2011).Combined Chemical Treatment Enables 0ct4-1nduced Reprogramming from MouseEmbryonic Fibroblasts.Stem Cells.[0021 ] Non-專利文件5:Zhu,S.,Li ,ff.,Zhou,H.,Wei ,ff.,Ambasudhan，R.,Lin，T.,Kim,J.,Zhang，K.和Ding，S.(2010).Reprogramming of human primary somatic cells by0CT4and chemical compounds.Cell Stem Cell 7,651-655.
【發明內容】
[0022]本發明的目的是提供用于維持誘導的多能干細胞的染色體穩定性的組合物，其包含至少一種選自下組的小分子化合物作為活性成分:ROCK抑制劑、MEK抑制劑、ALK5抑制劑和抗氧化劑。
[0023]本發明的另一目的是提供用于維持誘導的多能干細胞的染色體穩定性的方法，所述方法包括用上文所述的組合物處理誘導的多能干細胞，和用于培養誘導的多能干細胞的方法，所述方法包括用上文所述的組合物培養誘導的多能干細胞。
[0024]附圖簡述
[0025]圖1a示意性顯示在用于產生誘導的多能干細胞的方法中使用的整體實驗方案。
[0026]圖1b描繪了顯示用包含小分子組合物的組合物處理和不用所述組合物處理提供具有典型形態學的誘導的多能干細胞的照片。
[0027]圖1c是顯示用包含小分子化合物的組合物處理的誘導的多能干細胞和未用所述組合處理的誘導的多能干細胞之間重編程效率和速率的比較的圖。
[0028]圖2a和2b是顯示實施的RT-PCR和熒光染色分析以分析用包含小分子化合物的組合物處理的誘導的多能干細胞和未用所述組合處理的誘導的多能干細胞中多能性基因和蛋白表達的結果的圖。
[0029]圖3a描繪了顯示用包含小分子化合物的組合物處理的誘導的多能干細胞和未用所述組合處理的誘導的多能干細胞中分化成為三胚層的能力的熒光染色圖像。
[0030]圖3b描繪了顯示實施的組化檢查以確認通過崎胎瘤形成實驗在免疫缺陷小鼠中形成腫瘤后分化為三胚層，從而確認用包含小分子化合物的組合物處理的誘導的多能干細胞和未用所述組合處理的誘導的多能干細胞在體內分化能力的結果的圖。
[0031]圖4a顯示當無飼養細胞(feedercell)培養干細胞時，用包含小分子化合物的組合物處理的誘導的多能干細胞可以更穩定的方式維持而不引起不必要的分化的圖像。
[0032]圖4b和4c是顯示實施的細胞計數和PCR以檢查用包含小分子化合物的組合物處理的誘導的多能干細胞增殖能力增加和誘導的多能干細胞中多能基因的表達水平增加的結果的圖。
[0033]圖5a_5d顯示實施的通過對用包含小分子化合物的組合物處理的誘導的多能干細胞和未用所述組合處理的誘導的多能干細胞的熒光染色的細胞計數、免疫缺陷型小鼠中形成的腫瘤體積比較和形成EB(胚體)的能力比較的結果以確認誘導的多能干細胞分化能力增加。
[0034]圖6a是顯示比較用包含小分子化合物的組合物長時間培養的誘導的多能干細胞(miPSC( + ))、在誘導重編程后的初始培養階段用所述化合物處理但在傳代培養過程中未用所述組合物處理的誘導的多能干細胞(miPSC(±))和未用所述組合物處理誘導的多能干細胞(miPSC(-))之間的染色體異常的頻率從而確認包含小分子化合物的組合物防止染色體結構異常的結果的表。
[0035]圖6b和6c顯示在用包含小分子化合物的組合物長時間培養的誘導的多能干細胞(miPSC( + ))、在誘導重編程后的初始培養階段用所述化合物處理但在傳代培養過程中未用所述組合物處理的誘導的多能干細胞(miPSC(±))和未用所述組合物處理誘導的多能干細胞(miPSC(-))中分析顯示染色體數目和結構異常的代表性核型的結果從而確認包含小分子化合物的組合物防止染色體數目和結構異常。
[0036]圖6d顯示在用包含小分子化合物的組合物長時間培養的誘導的多能干細胞(miPSC( + ))、在誘導重編程后的初始培養階段用所述化合物處理但在傳代培養過程中未用所述組合物處理的誘導的多能干細胞(miPSC(±))和未用所述組合物處理誘導的