Il-21結合蛋白和其用圖
【專利說明】IL-21結合蛋白和其用途
[0001] 相關申請資料
[0002] 本申請要求2013年6月27日提交的標題為"A super-agoni st monoclonal antibody to human IL_21and its application in immunomodulation" 的澳大利亞臨時 專利申請號2013902377的優先權，其全部內容以引用的方式并入本文中。
[0003] 領域
[0004] 本公開涉及包含結合白介素-21(IL-21)的抗體的抗原結合位點的蛋白質和其用 途，例如，用于治療。
[0005] 序列表
[0006] 本申請與電子形式的序列表一起提交。序列表的全部內容以引用的方式并入本文 中且構成說明書描述的一部分。
[0007] 背景
[0008] 細胞因子一般刺激造血系細胞的增殖或分化，或參與機體的免疫和炎癥應答機 制。白介素是介導免疫學應答的細胞因子家族。對免疫應答關鍵的是T細胞，其產生許多細 胞因子且實現對抗原的適應性免疫。由T細胞產生的細胞因子被分類為TH1和TH2。1型細胞 因子包括IL-2、IFN_y、LT_a，且參與炎性應答、病毒免疫性、細胞內寄生物免疫性和同種異 體移植排斥反應。2型細胞因子包括11^-4、幾-5、11^-6、幾-10和11^-13，且參與體液應答、蠕蟲 免疫性和過敏應答。1型和2型之間的共有細胞因子包括IL-3、GM-CSF和TNF-a。有一些證據 表明產生1型和2型的T細胞群體優先迀移到不同類型的發炎組織中。
[0009] 天然殺傷(NK)細胞與T細胞和B細胞具有共同的祖細胞，并且在免疫監督中起作 用。構成血液淋巴細胞的多達15%的NK細胞不表達抗原受體，并且是先天免疫的組成部分。 NK細胞參與識別和殺傷腫瘤細胞和病毒感染的細胞。在體內，NK細胞被認為需要活化，然 而，在體外，NK細胞已經顯示在不活化的情況下殺傷一些類型的腫瘤細胞。
[0010] IL-21已經被證明是細胞毒性T細胞和NK細胞的有效調節劑(modulator) JL-21已 經顯示共刺激NK細胞的擴增，并且它已經顯示增強這些細胞的效應功能。T細胞應答包括增 強初次抗原應答作為對記憶T細胞功能的調節。
[0011]已經顯示IL-21R敲除小鼠與正常小鼠相比在抗原暴露之后表達較高水平的IgE和 較低水平的I gG 1。在給小鼠注射IL-21之后，I gE水平降低。這暗示由于I gE在過敏性1型應答 中的作用而帶來的IL-21在控制過敏性應答方面的作用。
[0012] 已經嘗試過IL-21作為用于減輕過敏性應答的療法。除了在小鼠鼻炎(鼻道炎癥） 模型中降低IgE水平以外，它還顯示成功地減少了由T細胞產生的促炎性細胞因子。這強烈 暗示了 IL-21控制局部和全身過敏的藥理學發展。
[0013] Li等（Journal of immunologyl75(4) :2261-9(2005))首先報道了IL-21 在調節人 T細胞的分化程序方面的作用，其中顯示了富集具有IL-2產生能力的獨特⑶28+CD127hi CD45R0+表型的中央記憶型CTL群體。通過在IL-21存在下進行初次免疫產生的腫瘤反應性 抗原特異性CTL產生了穩定的"非輔助細胞依賴性"表型。
[0014] IL-21被批準用于轉移性黑素瘤(MM)和腎細胞癌(RCC)患者的1期臨床試驗。顯示 了施用安全性，伴隨流感樣癥狀作為副作用。劑量限制性毒性包括低淋巴細胞、嗜中性粒細 胞和血小板計數以及肝毒性。根據實體腫瘤應答評估準則(RECIST)應答量表，47個MM患者 中有2個且19個RCC患者中有4個分別顯示了完全和部分應答。另外，在外周NK細胞和CD8+T 細胞中存在穿孔素、顆粒酶B、IFN- γ和CXCR3mRNA增加。這表明IL-21增強了 CD8+效應功能， 因此引起抗腫瘤應答。IL-21進入2期臨床試驗，其中它單獨或與如索拉非尼(sorafinib)和 利妥昔單抗(r i tux imab)的藥物聯合施用。
[0015] 幾-21還可能是控制持續性病毒感染的重要因子。與正常小鼠相比，感染慢性LCMV (淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒)的IL-21(或IL-21R)敲除小鼠不能夠克服慢性感染。此外， 這些具有受損的IL-21信號傳導的小鼠具有更顯著的LCMV特異性CD8+T細胞耗竭，表明由 CD4+T細胞產生的IL-21對于持續的CD8+T細胞效應子活性且然后為維持免疫性以消除持續 性病毒感染所需。因此，IL-21可能有助于CD4+T輔助細胞指揮免疫系統對病毒感染應答的 機制。
[0016] 在HIV感染受試者中，已經報道了 IL-21顯著改善了HIV特異性細胞毒性T細胞應答 和NK細胞功能。還顯示了來自于"HIV控制者(controller)"（通過在不進行治療的情況下控 制病毒復制而不會進展成AIDS的稀少個體）的HIV特異性CD4T細胞能夠產生與進展者 (progresses)的IL-21相比顯著更多的IL-21。另外，在HIV控制者中還優先發現了產生IL-21的病毒特異性⑶8T細胞。這些數據和IL-21刺激的⑶8或NK細胞能夠體外抑制HIV病毒復 制這一事實顯示，這種細胞因子可能潛在地可用于抗HIV治療劑。
[0017] 已經開發了針對IL-21的單克隆抗體，然而，這些抗體已經顯示能拮抗或抑制IL-21 的功能。這些拮抗性抗體可用于抑制炎性病癥。迄今為止，還沒有開發能激動或增強 IL-21 活性的抗體的公開文獻。 發明概要
[0018] 諸位發明人已經產生了結合IL-21且增強IL-21的活性的抗體。諸位發明人因此首 次開發出了充當IL-21激動劑的抗體。
[0019] 在一個實施例中，本公開提供了一種包含抗體的抗原結合結構域的IL-21結合蛋 白，所述抗原結合結構域結合或特異性結合IL-21且增強IL-21活性。
[0020] 在一個實施例中，所述IL-21結合蛋白增強IL-21介導的B細胞的體外或體內增殖。
[0021] 在另一個實施例中，所述IL-21結合蛋白增強IL-21介導的CD8+T細胞的體外或體 內細胞毒性。
[0022] 在另一個實施例中，所述IL-21結合蛋白增強IL-2介導的NK細胞的增殖。
[0023] 在一個實施例中，所述IL-21結合蛋白是IL-21激動劑。
[0024]在另一個實施例中，所述IL-21結合蛋白增加IL-21體內半衰期。舉例來說，所述 IL-21結合蛋白可以使IL-21體內半衰期從數小時增加到數天。在一個實施例中，所述IL-21 結合蛋白增加IL-21體內半衰期持續至少24小時。
[0025] 在另一個實施例中，IL-21的活性與不存在所述IL-21結合蛋白時的IL-21活性相 比增加至少五倍。
[0026] 本公開另外或替代地提供了一種包含抗體的抗原結合結構域的IL-21結合蛋白， 其中所述抗原結合結構域結合或特異性結合IL-21中包含序列STNAGRRQK(SEQ ID N0:23) 的表位。在另一個實施例中，所述IL-21結合或特異性結合包含如SEQ ID NO: 19中所闡述的 序列PPSTNAGRRQKHRLT的表位。在另一個實施例中，所述IL-21結合蛋白結合或特異性結合 11-21中包含如SEQ ID N0:20中所闡述的序列PPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYE的表位。在另一個 實施例中，所述IL-21結合蛋白結合或特異性結合IL-21中包含SEQ ID N0:4中所闡述的序 列 IKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYE 的表位。
[0027]本公開另外或替代地提供了一種包含抗體的抗原結合結構域的IL-21結合蛋白， 其中所述抗原結合結構域結合或特異性結合IL-21，且其中所述蛋白質競爭性地抑制抗體 2P2(包含有包含SEQ ID N0:2中所闡述的序列的VH和包含SEQ ID N0:3中所闡述的序列的 I)與IL-21的結合。
[0028] 在一個實施例中，所述IL-21結合蛋白競爭性地抑制抗體2P2與SEQ ID N0:19、20 或4中所闡述的表位序列的結合。
[0029]在一個實施例中，所述IL-21結合蛋白結合或特異性結合哺乳動物IL-21(hIL_ 21)。在另一個實施例中，所述IL-21結合蛋白結合或特異性結合人IL-21。在另一個實施例 中，所述IL-21結合蛋白結合或特異性結合貓或狗IL-21。
[0030]在一個實施例中，所述IL-21結合蛋白不會可檢測地結合小鼠IL-21。
[0031 ] 在一個實施例中，所述IL-21結合蛋白對于哺乳動物IL-21或hIL-21具有約9X10- 9M或更小的親和力常數(KD)。舉例來說，所述KD是約8 X 10、或更小或約7 X 10、或更小或 約6 X 10、或更小或約5 X 10、或更小。在一個實施例中，所述KD是約4.8 X 10、或更小。
[0032] 在另一個實施例中，所述IL-21結合蛋白對于哺乳動物IL-21或hIL-21具有約2X 10、或更小的親和力常數(K D)。舉例來說，所述KD是約1 X 10_9M或更小或約9 X 或更小 或約8X 10-1()Μ或更小或約7X 10-1()Μ或更小。在一個實施例中，所述Kd是約5X 10-1()Μ或更小。 在一個實施例中，所述Kd是約4Χ10_1()Μ或更小。在一個實施例中，所述KD是約3Χ10_ 1()Μ或更 小。在一個實施例中，所述Kd是約2 X 10_1()Μ或更小。在一個實施例中，所述KD是約1.5 X 10_1()Μ 或更小。
[0033] 在一個實施例中，涉及各前述實施例，所述Kd可以是0.1 X 10_12Μ或更大或1 X 10- 12Μ或更大。
[0034]在一個實施例中，所述Kd是使用生物傳感器，例如通過表面等離子體共振來評估。 舉例來說，對所述IL-21結合蛋白進行固定，并且測定與hIL-21或哺乳動物IL-21結合的水 平。
[0035]本公開另外或替代地提供了一種包含抗體的抗原結合結構域的IL-21結合蛋白， 其中所述抗原結合結構域結合或特異性結合IL-21，其中所述抗原結合結構域包含以下各 項中的至少一項：
[0036] (i)VH，其包含有包含與SEQ ID N0:5中所闡述的序列具有至少約80%、至少85%、 至少90%、至少92 %、至少95%、至少97 %、至少99%同一性的序列的互補性決定區（⑶R)1、 包含與SEQ ID N0:6中所闡述的序列具有至少約80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少 95%、至少97%、至少99%同一性的序列的⑶R2和包含與SEQ ID N0:7中所闡述的序列具有 至少約80 %、至少85 %、至少90 %、至少92 %、至少95 %、至少97 %、至少99 %同一性的序列 的CDR3;
[0037] (ii)VH，其包含與SEQ ID N0:2中所闡述的序列具有至少約95%或96%或97%或 98 %或99 %同一性的序列；
[0038] (iii)VL，其包含有包含與SEQ ID N0:8中所闡述的序列具有至少約80%、至少 85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列的CDR1、包含與SEQ ID N0:9中所闡述的序列具有至少約80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少 97%、至少99%同一性的序列的⑶R2和包含與SEQ ID N0:10中所闡述的序列具有至少約 80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少99%同一性的序列的CDR3; [0039] (iv)VL，其包含與SEQ ID N0:3中所闡述的序列具有至少約95%同一性的序列； [0040] (v)Vh，其包含有包含SEQ ID N0:5中所闡述的序列的CDR1、包含SEQ ID N0:6中所 闡述的序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:7中所闡述的序列的⑶R3;;
[0041 ] (vi)VH，其包含SEQIDN0:2中所闡述的序列；
[0042] (Vii)VL，其包含有包含SEQIDN0:8中所闡述的序列的CDRl、包含SEQIDN0 :9中 所闡述的序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:10中所闡述的序列的⑶R3;
[0043] (viii)VL，其包含SEQ ID N0:3中所闡述的序列；
[0044] (ix)VH，其包含有包含SEQ ID N0:5中所闡述的序列的CDR1、包含SEQ ID N0:6中 所闡述的序列的⑶R2和包含SEQ ID N0:7中所闡述的序列的⑶R3;和VL，其包含有包含SEQ ID N0:8中所闡述的序列的CDR1、包含SEQ ID N0:9中所闡述的序列的⑶R2和包含SEQ ID NO: 10中所闡述的序列的⑶R3;以及
[0045] (x)Vh，其包含SEQ ID N0:2中所闡述的序列；和Vl，其包含SEQ ID N0:3中所闡述的 序列。
[0046]在一個實施例中，所述序列與所述IL-21結合蛋白之間的差異是取代。
[0047] 技術人員將能夠確定對本公開的IL-21結合蛋白進行取代的位點，例如在含可變 區的蛋白質的骨架區內。
[0048] 本公開還提供了一種包含抗體的抗原結合結構域的IL-21結合蛋白，其中所述抗 原結合結構域結合或特異性結合IL-21且增強IL-21信號傳導，并且其中所述抗原結合結構 域包含有Vh，其包含SEQ ID N0:2中所闡述的序列；和VL，其包含SEQ ID N0:3中所闡述的序 列。
[0049] 在一個實施例中，本文中所描述的IL-21結合蛋白至少包含Vh和Vl，其中所述Vh和 I結合以形成包含抗原結合結構域的Fv。技術人員應理解，所述抗原結合結構域包含所述 抗體的結合位點。
[0050] 在一個實施例中，所述VH和所述九呈單條多肽鏈形式。舉例來說，所述蛋白質是：
[0051] (i)單鏈Fv片段(scFv);
[0052] (ii)二聚scFv(di-scFv);
[0053] (1^)與抗體的恒定區、？(：或重鏈恒定結構域(0〇2和/或&3連接的（1)或（^)之 -~??或
[0054] (iv)與結合免疫效應細胞的蛋白質連接的（i)或（ii)之一。
[0055] 在一個實施例中，所述VL和VH呈單獨的多肽鏈形式。
[0056]舉例來說，所述蛋白質是：
[0057] (i)雙抗體；
[0058] (ii)三抗體；
[0059] (iii)四抗體；
[0060] (iv)Fab；
[0061] (v)F(ab，）2;
[0062] (vi)Fv；
[0063] <>;[;0與抗體的恒定區、？(3或重鏈恒定結構域(002和/或&3連接的（;0至(>;0之 ，
[0064] (viii)與結合免疫效應細胞的蛋白質連接的（i)至(vi)之一。
[0065] 上述蛋白質還可以被稱為是抗體的抗原結合結構域。
[0066] 在一個實施例中，所述蛋白質是抗體，例如單克隆抗體。在一個實施例中，所述抗 體是裸抗體。
[0067] 在一個實施例中，蛋白質（或抗體)是嵌合的、去免疫的、人源化的、人的或靈長類 化的(primatized) 〇
[0068] 在一個實施例中，所述蛋白質或抗體是人的。
[0069]在一個實施例中，所述互補性決定區序列(CDR)根據Kabat編號系統來定義。
[0070] 在另一個實施例中，所述CDR根據頂GT編號系統來定義。
[0071] 本文中提及"結合" IL-21的蛋白質或抗體為"特異性結合" IL-21的蛋白質或抗體 提供文字支持。
[0072] 本公開還提供了上述抗體的抗原結合結構域或抗原結合片段。
[0073] 在一個實施例中，如本文中所描述的蛋白質或抗體包含人恒定區，例如IgG恒定 區，諸如IgG 1、IgG2、IgG3或IgG4恒定區或其混合物。在抗體或蛋白質包含VH和VL的情況下， 所述V H可以連接于重鏈恒定區且所述VL可以連接于輕鏈恒定區。
[0074] 可以例如在抗體或蛋白質的產生或純化期間或通過對編碼抗體重鏈的核酸進行 重組工程改造來去除本公開的整個抗體(或包含恒定區或Ch3的IL-21結合蛋白）的重鏈恒 定區的C末端賴氨酸。相應地，整個抗體(或IL-21結合蛋白）可以包括去除了所有C末端賴氨 酸殘基的群體、未去除C末端賴氨酸殘基的群體和/或具有存在和不存在C末端賴氨酸殘基 的蛋白質的混合物的群體。在一些實施例中，所述群體可以另外包括在重鏈恒定區之一中 去除了 C末端賴氨酸殘基的蛋白質。類似地，整個抗體的組合物可以包含存在或不存在C末 端賴氨酸殘基的抗體群體的相同或相似的混合物。
[0075] 在一個實施例中，如本文中所描述的蛋白質或抗體包含IgG4抗體的恒定區或IgG4 抗體的穩定化恒定區。在一個實施例中，所述蛋白質或抗體包含在241位具有脯氨酸的IgG4 恒定區（根據 Kabat 編號系統（Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest^Washington DC?United States Department of Health and Human Services， 1987和/或1991))。
[0076] 在一個實施例中，如本文中所描述的蛋白質或抗體或如本文中所描述的蛋白質或 抗體的組合物包含重鏈恒定區（包括穩定化重鏈恒定區），包含完全或部分存在或不存在C 末端賴氨酸殘基的序列混合物。
[0077]在一個實施例中，本公開的抗體包含與IgG4恒定區或穩定化IgG4恒定區（例如，如 以上所討論)連接或融合的本文中所公開的VH和與K輕鏈恒定區連接或融合的Vl。
[0078]本公開的IL-21結合蛋白的功能特征將被用來對本公開的抗體施加必要的修飾。
[0079] 在一個實施例中，如本文中所描述的IL-21結合蛋白或抗體是分離的和/或重組 的。
[0080] 在一個實施例中，本公開的IL-21結合蛋白或抗體與另一種化合物綴合，所述另一 種化合物例如可檢測標記或可延長所述蛋白質或抗體的半衰期的化合物，諸如聚乙二醇或 白蛋白結合蛋白。其他合適的化合物描述于本文中。
[0081] 本公開還提供了一種編碼本公開的IL-21結合蛋白或抗體或其多肽的核酸。
[0082] 本公開另外或替代地提供了一種包含抗體的抗原結合結構域的IL-21結合蛋白， 其中所述抗原結合結構域結合或特異性結合IL-21，其中所述抗原結合結構域是由包含以 下各項中的至少一項的核酸序列編碼：
[0083] (i)VH，其包含與SEQ ID N0:17中所闡述的序列具有至少約95%或96%或97%或 98 %或99 %同一性的序列；
[0084] (ii)VL，其包含與SEQ ID N0:18中所闡述的序列具有至少約95%或96%或97%或 98 %或99 %同一性的序列；
[0085] (iii)VH，其包含SEQIDN0:17中所闡述的序列；
[0086] (iv)VL，其包含SEQIDN0:18中所闡述的序列；以及
[0087] (V)VH，其包含SEQIDN0:17中所闡述的序列；和VL，其包含SEQIDN0 :18中所闡述 的序列。
[0088] 在一個實施例中，這樣的核酸被包括在表達構建體中，其中所述核酸可操作地連 接于啟動子。這樣的表達構建體可以處在載體，例如質粒中。
[0089] 在針對單多膚鏈IL-21結合蛋白的本公開實施例中，所述表達構建體可以包含與 編碼該多肽鏈的核酸連接的啟動子。
[0090] 在針對形成IL-21結合蛋白的多個多肽鏈的實施例中，表達構建體包含編碼包含 例如可操作地連接于啟動子的VH的多肽的核酸和編碼包含例如可操作地連接于啟動子的V L 的多肽的核酸。
[0091] 在另一個實施例中，所述表達構建體是雙順反子表達構建體，例如按5'至3'順序 包含以下可操作地連接的組分：
[0092] (i)啟動子
[0093] (ii)編碼第一多肽的核酸；
[0094] (iii)內部核糖體進入位點;和
[0095] (iv)編碼第二多肽的核酸，
[0096] 其中所述第一多膚包含VH且所述第二多肽包含九，或反之亦然。
[0097] 本公開還涵蓋單獨的表達構建體，其中一種編碼包含Vh的第一多肽且其中另一種 編碼包含VL的第二多肽。舉例來說，本公開還提供了一種組合物，其包含：
[0098] (i)第一表達構建體，其包含編碼包含可操作地連接于啟動子的VH的多肽的核酸； 和
[0099] (ii)第二表達構建體，其包含編碼包含可操作地連接于啟動子的VL的多肽的核 酸。
[0100] 本公開還提供了一種分離的或重組的細胞，其表達本公開的IL-21結合蛋白。
[0101] 在一個實施例中，所述細胞包括本公開的表達構建體或：
[0102] (i)第一表達構建體，其包含編碼包含可操作地連接于啟動子的VH的多肽的核酸； 和
[0103] (ii)第二表達構建體，其包含編碼包含可操作地連接于啟動子的1的多肽的核 酸，
[0104] 其中所述第一多膚與所述第二多肽締合以形成本公開的IL-21結合蛋白。
[0105] 本公開的細胞的實例包括細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
[0106] 本公開另外提供了用于產生本公開的IL-21結合蛋白或抗體的方法。舉例來說，這 樣的方法包括將本公開的表達構建體維持在足以產生IL-21結合蛋白或抗體的條件下。
[0107] 在一個實施例中，用于產生本公開的IL-21結合蛋白或抗體的方法包括在足以產 生和任選地分泌IL-21結合蛋白或抗體的條件下培養本公開的細胞。
[0108] 在一個實施例中，所述用于產生本公開的IL-21結合蛋白或抗體的方法另外包括 分離所述蛋白質或抗體，和任選地將所述IL-21結合