F標記組合物和方法及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及正電子發射斷層掃描(PET)成像的領域。更具體地，本發明涉及用于 PET成像的示蹤劑以及制備所述示蹤劑的方法。
【背景技術】
[0002] 由于其物理和核特性，正電子發射體氟-18是用于制備標記生物活性肽和小蛋白 質的低分子量放射性示蹤劑和放射性藥物的理想的放射性核素。氟-18衰變具有高正電子 豐度(99%)。與碳-11、氧-15和氮-13相比，氟-18的最低正電子發射能量(最大635keV)和在 組織中的最短正電子線性范圍（2.3mm)提供了 PET成像的最高分辨率。其相對較長的半衰期 (109.8分鐘)使得可以進行多步合成方法、在幾個小時內的延長的成像方案、動力學研究和 代謝產物分析。
[0003] 幾乎所有的現有技術的氟-18標記試劑被設計為通過氨基官能團偶聯到肽或蛋白 質。例如，活化酯4-[18F]氟苯甲酸N-琥珀酰亞胺基酯( 18F-SFB)是最流行的用于引入輔基來 標記肽和蛋白質的試劑之一，這通過酰化反應實現(2-4)。除了 18F-SFB，18F-標記的羧酸和 氨基試劑也是已知的。然而，它們主要用于與在所關注的生物材料中的氨基和羧酸基團的 偶聯相結合(5-10)，而不是用于PET探針設計和合成。這些現有技術的 18F-標記試劑的一個 主要缺點是，氨基和羧基官能團是在蛋白質中普遍存在的，因此，沒有可能對其選擇性標 記。
[0004] 考慮到上述情況，仍然需要一種能夠選擇性標記所關注的蛋白質或肽的新的標記 方法和試劑。
【發明內容】
[0005] 因此，本發明的一個目的是提供一種對可用作PET示蹤劑的化合物進行放射標記 的化學選擇性方法。
[0006] 本發明的另一個目的是提供新穎的PET示蹤劑，其在PET成像中具有令人滿意的生 理特性。
[0007] 考慮本發明的目的，本領域熟知在大多數肽和蛋白質中游離巰基基團不如氨基和 羧酸一樣普遍。因此，巰基反應性試劑已被用來在特定位點修飾肽和蛋白質，從而提供比羧 酸和胺反應性試劑更高的化學選擇性的一個手段。1989年，Shiue等率先開發使用 18F-標記 的N-取代馬來酰亞胺作為Michael受體的巰基反應試劑。合成了N-(對18F氟苯基)馬來酰亞 胺和間馬來酰亞胺基-N-(對 18F氟芐基)苯甲酰胺（11)用于在半胱氨酸位點處的Fab蛋白（來 白兔IgG)標記。在這一研究之后，報道了三種基于作為巰基選擇性試劑的 18F標記的N-取代 馬來酰亞胺的新方法。2003年，Toyokuni等人開發了作為疏基選擇性試劑的N-[4-[(4- 18F氟 亞芐基)氨基氧]丁基]馬來酰亞胺(18F-FBABM)(12)(圖1A)。在10分鐘內于室溫，在不優化反 應條件的情況下，含巰基的三肽谷胱甘肽與 18F-FBABM偶聯，得到約70%的經衰變校正的放 射化學產率(扣￥)。2005年，de Bruin等報道了另一種18F-馬來酰亞胺試劑l-[3-(2-(18F氟 吡啶-3-基氧基）丙基）吡咯-2，5-二酮（18F-FpyME)(圖IB)。18F-FpyME(13)通過三個連續步 驟合成，以[3-(3-Boc氨基丙氧基)吡啶-2-基]三甲基三氟甲磺酸銨為起始物。總反應時間 在110分鐘內，經衰變校正的放射化學產率為28%至37%。該巰基反應劑用于標記兩種8kDa 的含巰基蛋白質，得到60 %至70 %的分離產率(未經衰變校正）。2006年，Cai等合成了N-[ 2-(4-18F氟苯甲酰氨基）乙基]馬來酰亞胺(18F-FBEM)(圖1C)。通過 18F-SFB與N-(2-氨基乙基） 馬來酰亞胺偶合獲得了 18F-FBEM(14) APLC純化后，使巰基反應劑與含巰基R⑶肽的單體和 二聚物在室溫反應20分鐘，R⑶單體和二聚體總的經衰變校正RCY為20±4% (n = 5)。
[0008] 盡管上述現有技術中的巰基反應性標記試劑取得了初步成功，但是多步標記反 應、復雜的程序和相對低的產率限制了這些試劑應用。因此，現有技術的放射性標記的巰基 反應性試劑仍有許多不足之處。
[0009] 為了克服現有技術的上述困難，本發明的發明人發明了涉及新的試劑類型的放射 標記巰基反應劑和用于制造該試劑的方法的新途徑。
[0010] 本發明的一個方面是一種18F標記方法，其用于對存在或被引入到肽或蛋白的游離 疏基進行位點特異性標記。使用這種新方法合成了一種NTR1祀向PET成像劑，其表現出特定 的腫瘤攝取和優越的腫瘤對背景的對比度。提高的腫瘤相比主要器官的攝取率(包括腫瘤/ 腎）產生了在注射后的較早時間點的高對比度圖像。在正常組織中非常低的背景應使得可 以通過PET成像 18f-deg-vs-nt進行非常小的腫瘤的檢測(特別是在腹部區域）。
[0011] 因此，本發明的一個方面涉及一類新的能夠化學選擇性標記靶化合物的放射性標 記試劑。根據本發明的該方面的放射性標記試劑通常包括乙烯基砜官能團和放射性標記同 位素，通式為*R-L_VS，其中*R是放射性同位素，L為連接基團，且VS代表乙烯基砜官能團。 [0012 ] *R放射性同位素可以是任何在本領域中公知的合適的放射性同位素。示例性放射 性同位素可以是1工、？、8^但不限于此。在一個優選的實施方式中，放射性同位素是 1中。此 優選實施方式在本文中也稱為18F乙烯基砜或18F-VS。
[0013] 該連接基團L可以是任何具有可以容納乙烯基砜官能團和R*放射標記的官能部分 的合適的分子骨架。示例性連接基團可以選自芳族、脂族、PEG、含有雜原子的連接基團，但 不限于此。
[0014] 本發明的另一個方面涉及一種用放射性標記來選擇性地標記蛋白質或肽的方法。 根據本發明的這一方面的方法通常包括將如上所述的乙烯基砜放射性標記試劑連接至靶 蛋白質或肽的步驟。在一些實施方式中，提供或合成放射性標記試劑的步驟可以在連接步 驟前不久進行。本領域技術人員熟知，提供或合成步驟之前的時段受到所使用的特定*R標 記的半衰期的限制。在放射性標記具有較短的可用半衰期時，合成和連接*R_VS標記試劑至 靶蛋白/肽以及它們的最終應用之間的時間間隔較短。在這種情況下，放射性基團的連接必 須在使用標記的蛋白質/肽前很短的時間內發生，這需要當場執行所述標記方法的系統。在 其它情況下，當*R標記的半衰期長時，則靶蛋白質/肽的標記可以在大規模生產環境下非現 場進行，將得到的標記的蛋白質/肽以封裝的形式遞送。
[0015] 上述適用于被乙烯基砜標記試劑標記的蛋白質和肽一般包括至少一個半胱氨酸 殘基或游離硫反應性官能團，其能夠與標記物的乙烯基砜基團反應以形成穩定的連接。在 一些實施方式中，通過一個共價硫酯鍵形成連接。在其他實施方式中，可以通過非共價連接 進行連接。優選地，靶蛋白質/肽具有介于1至10個游離巰基反應性基團和/或半胱氨酸殘 基。更優選地，所述靶蛋白質/肽還具有生物功能，如酶底物或涉及某些致病途徑的結構成 分。在一個優選的實施方式中，靶蛋白質/肽是神經降壓素或其變體、或巰基化神經降壓素 變體、其他經穩定化的神經降壓素、多聚體神經降壓素、與其他配體的雜聚體神經降壓素。 在一個更優選的實施方式中，標記放射性同位素是 18F。最優選地，所述放射性標記試劑是 18f-deg-vs，而所靶向的肽是神經降壓素（即 18f-deg-vs-nt)。這種放射性標記的蛋白質或 肽可以在成像技術如正電子發射斷層掃描(PET)中用作示蹤劑。
[0016] 本發明的另一個方面涉及利用如上所述的本發明的新穎的示蹤劑進行PET成像的 方法。
[0017] 根據本發明的這個方面的方法一般包括:給受試者施用有效量的18F-VS示標記蹤 化合物的步驟;以及使用PET成像儀器對受試者在所關注位置進行成像的步驟。
[0018] 施用示蹤化合物的方法通常是本領域已知的，其可包括但不限于靜脈注射、口服 施用或其他本領域已知的方式。
[0019] 18F乙烯基砜至少具有下列優于18F標記馬來酰亞胺的優點：1)一步法18F-氟化前 體，以得到18F乙烯基砜;2)用乙烯基砜與巰基的反應的產物得到了單一立體異構體的結構， 這不同于會產生兩種可能的立體異構體的與馬來酰亞胺的偶聯;和3)這些乙烯基砜基團在 溶液中是長時間穩定的，因為它們在中性pH不水解(15)。因此，即使在水性緩沖液條件下使 用，它們保留優秀與含巰基的蛋白質或其他分子偶聯的潛力。
[0020] 本發明的再一個方面是涉及通過利用上述的放射性示蹤劑對生物或生理過程進 行成像的系統和裝置。圖7示出根據本發明的這個方面的系統/裝置的示例性示意圖。按照 本發明的這一方面的實施方式可以包括它們的傳統的自動化或半自動化盒、微波反應器或 微流控反應器或者它們的等同物。
[0021] 本發明的其它特征、目的以及優點將通過說明書和附圖以及由所附的權利要求變 得顯而易見。
【附圖說明】
[0022]圖1示出了根據本發明實施方式的18F-標記化合物的示例性合成方案和HPLC圖。 (A)F-DEG-VS的合成方案；（B)18F-DEG-VS粗反應的的HPLC圖譜；（C)富集 18F-DEG-VS的HPLC 圖譜。
[0023] 圖2. (A)F-DEG-VS-c(RGDyC)和F-DEG-VS-c(RGDyK)的化學結構；（B)放射性-HPLC (UV)上的 19F-DEG-VS-c (RGDyC)、19F-DEG-VS-c (RGDyK)、18F-DEG-VS與c (RGDyC) /c (RGDyK) (放射)的粗反應以及19F-DEG-VS-c (RGDyC)標準物的HPLC圖譜。
[0024] 圖3示出了根據本發明實施方式的示例性放射合成方案。(A)18F-DEG-VS-NT放射合 成方案。（B) 19F-DEG-VS和NT的粗反應的HPLC圖；（C) 18F-DEG-VS-NT (放射性)19F-DEG-VS-NT (UV)和（19F-DEG-VS) 2-NT (UV)的HPLC圖譜。
[0025] 圖4顯示了按照本發明的實施方式的競爭性結合測試的示例性結果。125I-NT(8-13)和19F-DEG-VS-NT或NT (8-13)在HT-29細胞中的競爭性結合測試。數據為平均值土 SE (η = 3) J軸反映了非放射性標記競爭物的濃度。19F-DEG-VS-NT和ΝΤ(8-13)的IC5Q值分別為2.03 ±0.22nmol/L 和 2.12±0.26nmol/L〇
[0026] 圖5.(A)攜帶HT-29異種移植體的小鼠在注射3.7MBq的不帶未經放射標記NT(8- 13)的18F-DEG-VS-NT (上圖）或帶未經放射標記NT (8-13)的18F-DEG-VS-NT (中圖）之后以及 在注射3.7MBq的18F-FBEM-NT(下圖）之后的代表性冠狀顯微PET圖像；（B)在攜帶HT-29異種 移植體的小鼠中在注射后(P. i .) 2小時的18F-DEG-VS-NT生物分布。
[0027] 圖6示出18F-DEG-VS-NT和18F-FBEM-NT在尿、腫瘤、腎和肝中的代謝穩定性。 18F- DEG-VS-NT和18F-FBEM-NT的保留時間分別為18.5分鐘和19.0分鐘。
[0028] 圖7示出在根據本發明的該方面的系統/裝置的示例性示意圖。
[0029] 圖8.18F-DEG-VS-NT于37C在1 XPBS中溫育5小時后的放射HPLC示蹤。
[0030]圖9.18F-DEG-VS-(Ac)-NT的放射合成方案和相應的放射HPLC示蹤。
[0031 ]圖10.18F-DEG-VS-c(RGDyC)標準物和在尿中的代謝穩定性的放射性HPLC圖譜。 [0032]圖 11 · (A)18F-FBEM的放射合成方案；（B)18F-FBEM-c(RGDyC)和 18F-FBEM-NT的化學 結構。
[0033]圖12.18F-FBEM-c(RGDyC)標準物和在尿中的代謝穩定性的放射性HPLC圖譜。
[0034] 圖13·(A)注射18F-DEG-VS-NT和18FBEM-NT后2小時的攜帶HT-29腫瘤的小鼠的二維 投影顯微PET圖像（箭頭表示HT29腫瘤）；⑶注射 18F-DEG-VS-NT和18FBEM-NT后的腫瘤、腎、 肝、肌肉的時間活性曲線。
【具體實施方式】
[0035] 定義
[0036]除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有如本發明所屬領域的普 通技術人員能通常理解的相同的含義。在有矛盾的情況下，將以本文本(包括定義)為準。在 此提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻通過引用以整體并入本文。本文公開 的材料、方法和實例只是說明性的，并不旨在進行限制。
[0037] 如本文所用，術語"氨基酸"是D或L形式的天然氨基酸殘基（例如Ala、Arg、Asn、 Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Hyl、Hyp、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和 Val)，以及具有一個或多個開放價的非天然氨基酸(例如，磷酸絲氨酸;磷酸蘇氨酸;磷酸酪 氨酸;輕脯氨酸；γ -羧基谷氨酸；馬尿酸;八氫吲哚-2-羧酸;抑胃酶氨酸；1，2，3，4-四氫 異喹啉-3-甲酸;青霉胺：鳥氨酸;瓜氨酸; α_甲基丙氨酸;對苯甲酰基苯丙氨酸；苯基甘氨 酸;炔丙基甘氨酸;肌氨酸;和叔丁基甘氨酸)殘基。該術語還包括攜帶有氨基保護基(例如 乙酰基、酰基、三氟乙酰基或芐氧基羰基）的天然和非天然氨基酸，以及在羧基處被保護基 團保護(例如，保護為(Q-C6)烷基酯或酰胺、苯基酯或酰胺或者芐基酯或酰胺）的天然和非 天然氨基酸。其他合適的氨基和羧基保護基團也是本領域技術人員已知的(例如，參見T.W. Greene^Protecting Groups In Organic Synthesis;Wiley:New York，1981;D·Voet， Biochemistry?ffiley：New York?1990；L Stryer^Biochemistry?(3rd Ed.)?ff H.Freeman and Co:New York，1975;J.March，Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms and Structure，（2nd Ed·)，McGraw Hi 11:New York，1977;F·