一種快速檢測小反芻獸疫病毒的rt-rpa檢測試劑盒及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測小反芻獸疫病毒的試劑盒及其用途，特別涉及一種快速檢測 小反芻獸疫病毒的RT-RPA檢測試劑盒及其用途，本發明屬于預防獸醫學檢驗領域。
【背景技術】
[0002] 自PCR技術誕生以來已經有三十年了。從經典PCR、實時定量PCR再到現在的數字 PCR，這一技術在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。但是該技術需要特殊昂貴的熱循環儀器 以及熟練的操作人員，費時費力，難以用在現場診斷以及實驗條件差的地方。重組酶聚合酶 擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA)自從2006年被英國TwistDx Inc公司 開發出來以來，就被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。以此為基礎的TwistAmp?核酸 擴增產品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬件設備的要求很低， 特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。標準TwistAmp?試劑盒 的運行溫度在37°C_42°C之間。進行實時監控的體系（如TwistAmp?ex 〇試劑盒），需要能夠 激發和檢測熒光團的恒溫裝置，比如酶標儀或實時檢測的熱循環儀。
[0003] 自開發以來，該技術已經被廣泛的應用到人類疾病、獸醫藥物、食品工業以及農業 上，比如用于檢測土拉弗朗西斯菌、細螺旋體、HIV-1DNA、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、天花病毒、B 型鏈球菌、大腸桿菌產生的志賀毒素、中東呼吸綜合征冠狀病毒、裂谷熱病毒、口蹄疫病毒、 牛冠狀病毒、埃博拉病毒、蘇丹病毒、馬爾堡病毒、施馬倫貝格病毒、牛病毒性腹瀉病毒、黃 熱病毒以及戈登病毒等病原。與常規方法相比較，等溫擴增實驗具有很高的敏感性和特異 性，這促使不同的公司商業化不同的等溫擴增技術，比如，環介導的擴增(LAMP;Eiken，日 本），RPA(RPA;Alere, USA and TwistDx, UK)，鏈置換擴增（strand displacement amplification，Becton Dickson,USA) ΙΑΜΡ技術已經比較成熟，并且得到廣泛使用，到目 前為止，已經超過1000份關于LAMP在不同疾病診斷中應用的科研文章。與RPA相比較，LAMP 技術具有試驗設計比較麻煩(3對引物），特異性相對較弱(能擴增很多條帶），時間仍然相對 較長，以及易于污染等不足的地方。
[0004] 小反會獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)又名小反會獸偽牛痕，是由小反 芻獸疫病毒(PPRV)引起的一種急性、烈性、接觸性傳染病，發病率和死亡率均非常高。0ΙΕ曾 將該病列為法定必報的A類動物傳染病，一旦發現必須采取緊急嚴厲的措施控制和撲滅。自 從1940年首次確認該病的存在以來，該病隨后在大多數非洲國家、中東地區以及印度、巴基 斯坦以及中國等國均有報道，對我國養羊業構成了嚴重威脅。PPRV基因組全長為15,948個 核苷酸，含有6個轉錄單位編碼6個連續的非重疊的蛋白，這些蛋白以5'-L-HN-F-M-P/C/V-N-3'的順序編排。基于N蛋白的不同，PPRV可以被分為四大類，這種分類方式能很好的反映 PPRV存在的地域差異。N蛋白雖然不具有免疫保護作用，但是該蛋白是PPRV編碼的所有蛋白 中豐度最高以及最具有免疫原性的蛋白，這是N蛋白被廣泛的應用到診斷方法的開發中的 原因。
[0005] Jingyue Bao等（Development of one-step real-time RT-PCR assay for detection and quantitation of peste des petits ruminants virus. Journal of Virological Methods 148(2008)232-236)建立了一種一步法實時熒光定量RT-PCR方法用 于檢測小反芻獸疫病毒，該方法能夠檢測并定量PPRV，特異性較強，在臨床上得到了較為廣 泛的應用。但是該方法需要復雜的試驗設備以及熟練的操作人員，且需要較長的實驗時間 (大約 1.5h)。
[0006] Lin Li等（Rapid detection of peste des petits ruminants virus by a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay.Journal of Virological Methods 170(2010)37-41)建立了一種用于檢測小反芻獸疫病毒的RT-LAMP 方法，該方法能夠更加便捷和快速的檢測PPRV。但是，通過RT-LAMP的擴增結果表明，該方法 能夠出現很多擴增條帶，因此存在非特異性擴增，而且該方法需要設計三對引物來進行擴 增，因此增加了實驗設計的難度，并且增加了其與其他檢測平臺相結合的難度。并且檢測溫 度較高(63°C)，檢測時間較長(60min)，還需要通過核酸電泳對擴增產物進行檢測，增加了 污染的可能性。
[0007] 針對現有技術中存在的問題，本發明中針對PPRV的N基因，研發并評估了基于熒光 探針的實時熒光RT-RPA方法(PPRV real-time RT-RPA)，可用于快速檢測PPRV。重組酶聚合 酶技術(recombinase polymerase amplification，RPA)由于其具有快速、簡便、無需特殊 儀器等優點，目前已被應用于多種重要疾病病原的檢測中。但是目前國內外尚無基于RPA診 斷小反會獸疫病毒的報道。
【發明內容】
[0008] 本發明所要解決的技術問題是提供一種能快速、簡單、特異的鑒定小反芻獸疫病 毒的檢測方法及試劑盒。
[0009] 為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：
[0010] 本發明發明人針對小反芻獸疫病毒N區域設計引物和探針。同時通過對來自于 GenBank 中的 X74443，L39878，EU267274，EU267273，AJ849636，FJ905304，AY560591 和 AJ563705的N基因同源序列進行比對分析，以進一步確定小反芻獸疫病毒的保守區域，以期 能夠檢測到盡可能多的小反芻獸疫病毒。所有的引物和探針都由生工生物(上海，中國）合 成。本發明分別設計合成了三對上游引物和三對下游引物，通過對引物與探針組合進行擴 增效果評價，最終將其中一對能夠產生最強的擴增信號的引物對與探針組合應用到本發明 中。
[0011]特異性實驗表明本發明方法能夠特異性的檢測小反芻獸疫病毒，并且在同等條件 下對綿羊痘病毒、山羊痘病毒、羊口瘡病毒以及口蹄疫病毒等其他重要的羊感染病毒沒有 擴增，說明該方法具有很好的特異性。靈敏度實驗表明本發明所設計的用于檢測小反芻獸 疫病毒的RT-RPA引物和探針能夠在40°C下，擴增20min的條件下最少可檢出150個拷貝的模 板。本發明不僅僅對該方法的敏感性和特異性進行了評估，并同時用臨床樣品對該試驗結 果進行評估，并與RT-qPCR相對應的結果進行比較，結果證明本發明方法與RT-qPCR具有很 高的符合度。因此，本發明的鑒定小反芻獸疫病毒的檢測方法能夠快捷、高效、靈敏的檢測 小反芻獸疫病毒，為小反芻獸疫病毒的鑒別診斷提供了有效技術手段。
[0012]在上述研究的基礎上，本發明提出了一種用于快速檢測小反會獸疫病毒的RT-RPA 檢測試劑盒，其包括有一對引物和一條探針，
[0013]其中，所述的一對引物和一條探針的序列如下所示：
[0014] 上游引物：5'-CCAAGGCGGTTACGGCACCGGATACGGCAGCTGAC-3'（SEQ ID N0.1 所示）；
[0015] 下游引物：5'-ACTGCGTCCAGCCACCCTTTGTCAAGGCGAAATTC-3'（SEQ ID 從).2所示）；
[0016] 探針：5 ' -GATACGGCAGCTGACTCAGAACTGAGAAGG
[0017] -(FAM-dT)-G-(THF)-G-(BHQl-dT)-TAAATACACACAACA-P-3'（SEQ ID 從).3所示）。
[0018] 其中，BHQl-dT表示攜帶有熒光淬滅基團BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氫呋 喃連接子，FAM-dT表示攜帶有熒光素基團的胸腺嘧啶核苷酸，P表示磷酸阻止鏈的延伸。
[0019] 在本發明中，優選的，所述試劑盒中還包括水解緩沖液(