一種蒙古沙冬青染色體熒光原位雜交的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞遺傳學與分子生物學技術領域，更具體地說，涉及一種蒙古沙冬青染色體熒光原位雜交的方法。
【背景技術】
[0002]焚光原位雜交(fluorescencein situ hybridizat1n, FISH)是20世紀80年代末開始發展起來的一種重要的非放射性標記原位雜交技術，在研究植物分子細胞遺傳學、基因擴增、基因作圖及植物進化和親緣關系的鑒定上已廣泛應用，重復DNA序列、多基因家族作為探針與染色體原位雜交，容易產生較高的分辨率，因為這些DNA多拷貝序列在染色體上可達幾十個kb或幾個Mb。
[0003]核糖體rRNA基因是生物最重要的管家基因之一，其轉錄產物與核糖體蛋白質一起組裝成核糖體。高等植物核主體抑嫩(185、5.85、285)和55 rDNA是由高度重復的序列組成，它們是基因編碼區，選擇壓力大，屬高度保守區，在植物基因組中有幾百乃至上千拷貝，它們以串聯重復排列的方式成簇分布在染色體的一個或數個部位，采用18S rDNA和5SrDNA探針對植物染色體進行熒光原位雜交(FISH)可以定位18SrDNA和5S rDNA在染色體上的位置，為植物基因組的進化和核型分析提供重要信息。
[0004]蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongo I i cus )是豆科蝶形花亞科沙冬青屬(Ammopiptanthus)旱生植物，為古老的殘遺、瀕?危物種，主要分布在我國西北地區的沙漠、荒漠區，是該區唯一的常綠闊葉灌木。由于蒙古沙冬青染色體較小及制片方法問題，染色體核型分析結果不一致，先后有兩個研究組報道，蒙古沙冬青核型公式為2n=2x=18=6m(2SAT)+ 10sm(2SAT)+2st，屬于3A型，即由3對中部、5對近中部和I對近端部著絲點染色體組成，對于蒙古沙冬青染色體形態小，相似程度高，需要用熒光原位雜交技術，以更精密的辨析蒙古沙冬青的染色體，通過改造染色體制片技術和優化傳統染色體原位雜交方法，獲得分散開，形態好，熒光信號強的中期染色體玻片，更好地辨析蒙古沙冬青染色體，以應用于蒙古沙冬青的核型分析與進化研究.因此，當前技術一種快速、精確的染色體熒光原位雜交技術，觀察到分散好、熒光信號強的染色體分裂相。
【發明內容】
[0005]本發明提供一種蒙古沙冬青染色體熒光原位雜交的方法。
[0006]為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下:一種蒙古沙冬青染色體熒光原位雜交的方法，包括以下步驟:
SI:染色體玻片標本的制備，蒙古沙冬青種子在28°C溫箱中常規培養，待根尖生長至2-3厘米時，切下生長旺盛的根尖在1.5毫升離心管中保持濕潤，置密閉容器中用N2O處理2.5小時，取出根尖用90%冰醋酸處理10分鐘，即轉入70%乙醇中固定，置_20°C長期備用，取固定后的2-3個根尖，用蒸餾水洗凈，切生長點放入含1%果膠酶和2%纖維素酶的緩沖液中，37°C解離45分鐘，離心先后用冷蒸餾水，無水乙醇洗滌兩遍，最后放入30微升冰醋酸中，每張玻片滴5微升左右懸液展片，空氣干燥后放紫外交聯儀處理固定染色體，鏡檢分散良好的染色體玻片，置_20°C長期備用；
S2:18SrDNA、5SrDNA和端粒探針制備與探針變性，選取同屬于豆科的植物大豆5SrDNA和18SrDNA序列設計引物，以蒙古沙冬青為模板擴增重復序列，采用Nick translat1n法制備探針，端粒采用擬南芥端粒DNA序列為探針，Aml3引物為fwd和Aml3以蒙古沙冬青為模板擴增重復序列;分別標記FITC綠色和Texas Red紅色熒光；
S3:探針與染色體共變性，制備好的染色體玻片，經過120-125毫焦/平方厘米的紫外交聯儀處理I分鐘固定染色體，在染色體位置加5微升的探針，其質量不超過100納克，蓋上蓋玻片，放入密閉保濕的飯盒中，在沸水中煮沸15分鐘，迅速冷卻變性的染色體和探針；
S4:雜交與雜交后洗脫，遮光變性的玻片和探針，取出玻片放入55°C烘箱中，經過大于4小時的保溫復性雜交，取出玻片置于含2 X SSC溶液的玻片染色缸中，室溫漂洗5分鐘，去除玻片，接著轉至另一含2 X SSC溶液的玻片染色缸，55°C漂洗25分鐘，取出玻片，空氣晾干后保濕；
S5:制片與信號檢測，在制備好的玻片上滴加熒光染料5微升DAPI和5微升2 X SSC溶液，蓋上蓋玻片，在蓋玻片上覆上吸水紙，用橡皮敲打1-2分鐘，使用德國DM750M徠卡金相顯微鏡觀察，找到良好的染色體分裂相，用不同的激發光獲得，藍色，紅色和綠色的雜交信號；用Lecia CW4000 FISH software進行圖像米集與合成。
[0007]進一步地，所述步驟S2中的Nick translat1n法制備探針，成分為:DNA (200納克/毫升),10.0微升;10X Nick translat1n緩沖液，2.0微升；熒光標記的dNTP(ImM) ,0.5微升;無熒光標記的dNTPs(2 mM)，2.0微升;DNA聚合酶I(10U/微升)，8.0微升;DNase (100mU/微升)，0.4微升；總體積22.9微升；制備方法為:混合物混勻后放入PCR儀15° C保溫2小時；加入175微升的含140納克/微升鮭魚精DNA的5 X TAE pH 5.2終止反應，并混勻，加入500微升大于2小時沉淀探針后16000rpm;離心30分鐘，70%乙醇洗滌2遍，加入100微升的2 XSSC溶解探針，使探針終濃度為20納克/微升，_20°C避光儲存備用。
[0008]更進一步地，所述蒙古沙冬青的核型模式為2n = 2x =18= 2sm(SAT)+ 6 m + 8sm + 2st0
[0009]相比于現有技術，本發明的有益效果為:
(I)本發明在現有技術基礎上，用N2O處理根尖，采用90%冰醋酸固定1min后轉入70%乙醇保存，酶解后，用冰浴蒸餾水與無水乙醇兩次洗滌后，加冰醋酸展片，使蒙古沙冬青中期染色體凝聚較好，根尖細胞解離充分，染色體分散均勻、容易計數。
[0010](2)本發明的探針制備放在15°CPCR儀保溫2 h，時間溫度精確控制，然后沉淀純化探針。
[0011](3)采用紫外交聯儀固定玻片染色體，減少染色體被洗脫風險。
[0012](4)用沸水浴煮沸探針與染色體一起變性，方法簡單，無污染。
[0013](5)采用2XSSC室溫洗脫和2XSSC 55°C洗脫相結合的方法，步驟簡便，無污染。
[0014](6)本發明清楚地顯示了蒙古沙冬青的染色體，熒光信號強，雜交特異性高，確定了適合蒙古沙冬青的FISH方法。
[0015](7)本發明通過觀察18SrDNA、5SrDNA、Aml3和端粒(Telomere)的探針在蒙古沙冬青染色體上的分布，辨析同源染色體與非同源染色體，有助于核型分析，對于蒙古沙冬青染色體物理圖譜構建，引種栽培和資源的保護利用具有重要的理論和實踐意義。
【附圖說明】
[0016]圖1為蒙古沙冬青中期分裂相圖像；
圖2為蒙古沙冬青18S rDNA(綠色，白色箭頭)和端粒(紅色)信號點分布圖像；
圖3為蒙古沙冬青18S rDNA(綠色)和端粒(紅色)核型分析圖；
圖4為蒙古沙冬青5S rDNA(綠色，白色箭頭)和Aml3(紅色)信號點分布圖像；
圖5為蒙古沙冬青5S rDNA(綠色)和Aml3(紅色)核型分析圖；
圖6為蒙古沙冬青18SrDNA、5SrDNA、Aml3和端粒(Telomere)核型分析模式圖；
圖7為蒙古沙冬青的5S rDNA (a_d)紅色和18S rDNA (e_h)綠色熒光原位雜交結果圖。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例對本發明進一步進行描述。
[0018]如圖1所示，本發明提供了一種蒙古沙冬青染色體熒光原位雜交的方法，包括以下步驟:
SI:染色體玻片標本的制備，蒙古沙冬青種子在28°C溫箱中常規培養，待根尖生長至2-3厘米時，切下生長旺盛的根尖在1.5毫升離心管中保持濕潤，置密閉容器中用N2O處理2.5小時，取出根尖用90%冰醋酸處理10分鐘，即轉入70%乙醇中固定，置_20°C長期備用，取固定后的2-3個根尖，用蒸餾水洗凈，切生長點放入含1%果膠酶和2%纖維素酶的緩沖液中，37°C解離45分鐘，離心先后用冷蒸餾水，無水乙醇洗滌兩遍，最后放入30微升冰醋酸中，每張玻片滴5微升左右懸液展片，空氣干燥后放紫外交聯儀處理固定染色體，鏡檢分散良好的染色體玻片，置_20°C長期備用；
S2:18SrDNA、5SrDNA和端粒探針制備與探針變性，選取同屬于豆科的植物大豆5SrDNA和 18SrDNA序列設計弓 I 物，5s-fwd(tgcgatcataccagcactaatg) ； 5s_rev:tgcaacacgaggacttcc和18s_fwd(5，-AAGTCGTAACAAGGTTTC-3，)；18s_rev(5，_TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)以蒙古沙冬青為模板擴增重復序列，采用Nick translat1n法制備探針，端粒采用擬南芥端粒DNA序列