鑒定猴頭菇猴杰2號的引物對及方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子鑒定技術領域，特別是涉及一種鑒定猴頭菇猴杰2號的引物對及 方法。
【背景技術】
[0002]猴頭燕(Hericium erinaceus)，又叫猴頭菌，只因外形酷似猴頭而得名。猴蘑，猴 頭，猴菇，是中國傳統的名貴菜肴，肉嫩、味香、鮮美可口。猴頭菇是一種食藥用兼備的珍稀 菌類，其子實體和發酵菌絲均可入藥。隨著人民生活水平的提高，猴頭菇也進入了普通家 庭，特別是"非典"以后，猴頭菇的營養及藥用價值更加被認識，猴頭菇市場消費急增，廣闊 的市場需求使人工栽培迅速發展。
[0003] 隨著猴頭菇產業的快速發展，對高產、抗逆的猴頭菇種質資源需求愈加迫切。但由 于猴頭菇品種本身具有無性繁殖的遺傳特性，使得在菌種市場上同種異名，異種同名、假 種、劣種現象普遍存在，再加上菌種質量的退化現象，不僅極大地損害了猴頭菇生產者和育 種者的利益，也影響了猴頭菇產業的持續健康發展。因此，建立起一套科學可靠、快速便捷 的猴頭菇品種鑒定體系至關需要。而我國目前對猴頭菇品種質量的監督管理，主要依靠在 生產層面制定的各項生產技術標準，而在菌種質量技術層面尚未取得關鍵性突破，特別是 缺乏猴頭菇良種的早期快速鑒別技術體系。
[0004] 就全國范圍內來看，目前猴頭菇主栽品種為15個，包括猴杰2號、猴頭菇99、猴頭菇 G2M5.496、猴頭菇G2M5.497、猴頭菇920、猴頭菇911、猴頭菇99-1、猴頭菇H6、猴王、大猴頭、 猴頭6號、常山猴頭菇、猴頭BJ-5、福建猴頭菇、猴頭菇19號。對這些猴頭菇品種的鑒別主要 依據猴頭菇菌絲、菌落和子實體形態的宏觀現察、生長特性、生理生化反應以及不同菌株間 發生的拮抗反應等，但由于這些方法易受環境因素和生理狀況的影響，并且隨著品種數量 不斷增多，使得品種鑒定愈來愈困難。
[0005] 自本世紀以來，一些基于PCR的分子標記技術如RAPD(Random Amp 1 ified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat，簡單序列 重復區間擴增多態性）和SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism，相關序列擴 增多態性)相繼用于了猴頭菇的種質資源遺傳多樣性、遺傳距離研究，但對于分子標記與猴 頭菇性狀的連鎖、猴頭菇品種間的分子鑒別研究很少。況且，這些分子標記技術所采用的均 為通用引物，其PCR擴增圖譜不僅復雜、重復性差，而且特異性不高，因此并不適合用于品種 鑒別，只有開發出某個品種穩定、特異的DNA指紋標記才能真正用于該猴頭菇品種的準確快 速鑒定。
[0006] CN101985657A公開了 一種利用分子標記技術鑒定猴頭燕菌種猴王的方法，包括菌 絲培養與收集，基因組DNA的提取，SCAR-PCR分子標記的檢測建立和SCAR-PCR產物的檢測。 使用此發明公開的分子特異性引物猴王F2/R2檢測引物進行PCR擴增，猴頭菇菌種猴王的特 征擴增產物為371bp<XN101402994A公開了一種利用分子標記技術鑒定猴頭燕菌種猴杰的 方法，具體步驟與CN101985657A中類似，使用此發明公開的分子特異性引物進行PCR擴增， 猴頭菇菌種猴杰的特征擴增產物為414bp。
【發明內容】
[0007] 本發明提供了一種鑒定猴頭菇猴杰2號的引物對，該引物對特異性高，利用PCR法 進行鑒定操作方便，結果準確。
[0008] 弓丨物對，包括上游引物和下游引物：
[0009] 上游引物為：5' -CAAACCGGTGTCAGGGAACTGC-3'，
[0010] 下游引物為：5' -ACGAAITTGAATCCTCCACGTCGAA-3'。
[0011 ]利用序列相關擴增多態性（Sequence-related Amplified Polymorphism，SRAP) 分子標記技術對猴頭菇主栽品種的分子鑒別進行探索性研究。提取各猴頭菇品種的菌絲基 因組DNA作為模板，用大量SRAP隨機引物對進行PCR擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測， 最后篩選得到具有差異條帶(僅猴頭菇猴杰2號有而其余品種沒有）的引物一對。將該差異 條帶進行切膠回收，然后連接到克隆載體上送去測序，所得DNA片段大小為597bp，其堿基序 列如SEQ ID No. 1所示，該DNA片段為猴杰2號的特異性DNA片段。由該猴杰2號的特異性DNA 片段設計得到所述引物對。
[0012]以猴頭菇基因組DNA為模板，利用所述引物進行PCR擴增，僅猴杰2號可穩定獲得 597bp大小的特異性DNA片段，而其他猴頭菇品種均不能獲得該特異性DNA片段。
[0013]本發明又提供了所述引物對在鑒定猴頭菇猴杰2號中的應用。
[0014] 本發明還提供了所述引物對在制備鑒定猴頭菇猴杰2號的試劑盒中的應用。所述 試劑盒包括所述引物對、DNA提取試劑，PCR所用的聚合酶、緩沖液、dNTP等相關試劑。
[0015] 本發明還提供了所述引物鑒定猴頭菇猴杰2號的方法，包括以下步驟：
[0016] (l)DNA 提取，
[0017] (2)PCR 擴增，
[0018] (3)電泳檢測，
[0019]若電泳檢測結果出現597bp大小的DNA條帶，則待測猴頭菇品種為猴頭菇猴杰2號， 反之則否。
[0020]本發明方法關鍵在于擴增引物的選擇，至于DNA提取、PCR反應體系和反應條件，以 及電泳檢測，均可按照本領域常規方法進行。
[0021 ]優選的，本發明所述PCR反應體系組成如下： 2><Power Taq PCR Master Mix 10 fiL 10 μΜ上游引物
[0022] 10 μΜ 下游引物 1 ·5>L .20 ng/pL 模板 DNA 3 pL ddHiiO 4 μLα
[0023] 其中2XPower Taq PCR Master Mix購自北京百泰克生物技術有限公司。
[0024] 所述的PCR擴增條件為:94°C預變性7min; 94°C變性45min，58.5°C退火45s，72°C延 伸2min，共30個循環;72°C延伸7min;4°C保溫。
[0025]利用所述引物對擴增猴頭菇猴杰2號獲得的597bp的DNA片段可以作為猴頭菇猴杰 2號分子標記，堿基序列如SEQ ID No. 1所示。
[0026] 本發明還提供了所述猴頭菇猴杰2號特異性DNA片段作為分子標記在鑒定猴頭菇 猴杰2號中的應用。
[0027] 當然，在所述猴頭菇猴杰2號特異性DNA片段的基礎上，對所述引物對進行個