的信號放大核酸適配體傳感器及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農產品質量安全檢測技術領域，具體涉及一種測定黃曲霉毒素 m的信 號放大核酸適配體傳感器及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是谷物、花生、玉米、油籽等多種糧食和飼料中常見的 真菌毒素污染物，已經成為影響食品安全、危害人類和動物健康的巨型殺手。黃曲霉毒素是 一類由黃曲霉和寄生曲霉產生的二氫呋喃香豆素的衍生物，目前已經發現的有AFBhAFBs、 AFGi、AFG2、AFMi和六?12等18種，具有誘導突變、抑制免疫和致癌作用，被世界衛生組織的癌 癥研究機構劃定為I類致癌物質。天然食物中以六?8 1最為多見，其危害性也最強。AFBi的毒性 要比嘔吐毒素的毒性強30倍，比玉米赤霉烯酮的毒性強20倍;AFBj^急性毒性是氰化鉀的 10倍，砒霜的68倍，慢性毒性可誘發癌變，致癌能力為二甲基亞硝胺的75倍，比二甲基偶氨 苯高900倍，人的原發性肝癌也很可能與黃曲霉毒素有關。因此，目前世界上很多國家已經 對食品和飼料中的AF含量提出了嚴格的限量標準，其中尤以歐盟提出的標準最為苛刻，規 定AFBi含量不得超過2ppb，總AF含量不得超過4ρρ1^ΑΡΒι的快速、靈敏、準確分析對于減少AF 對人類生命安全的危害、保證國際進出口貿易的暢通具有極其重要的作用。目前AFBi的檢 測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、薄層層析法(TLC)、酶聯免疫法(ELI SA)等。這些方法 雖取得了較大進展，但仍然存在操作要求高、步驟過于繁瑣、靈敏度較差、誤檢率高、儀器昂 貴等不同缺陷。
[0003] 核酸適配體是一段單鏈寡核苷酸(20~60堿基），通過折疊能夠形成特有的三維結 構，從而與靶分子高親和力、高特異性結合。與抗體相比，核酸適配體的優點在于:特異性 高、容易進行化學合成、改造與標記、生物化學穩定性好，能可逆地進行變性與復性，還能充 分利用工具酶進行擴增、剪切等后續信號放大處理。各種基于核酸適配體的分析、檢測方法 與技術已呈現出快速、靈敏、方便、低成本等優點，在生物醫學應用中已經顯示出廣闊的應 用前景，但在真菌毒素檢測方面的應用卻相對較少。
[0004] 電化學生物傳感檢測方法具有快速、靈敏、儀器設備簡單等特殊優勢。近年來國內 外研究者對AFBi的電化學生物傳感器的構建進行了多方面的努力和嘗試，分別研究了以抗 體、DNA和酶作為識別元素的電化學生物傳感器，并將納米技術、離子液體、導電聚合物等技 術應用于AFBj^分析中，極大地豐富了電化學生物傳感器和真菌毒素分析的研究內容和思 路。
[0005] 所以，本發明利用新型分子識別元件一一核酸適配體的高特異性特點，結合核酸 外切酶循環酶切的信號放大功能，同時利用電化學簡單快捷、高靈敏的優點，構建了一種測 定黃曲霉毒素出的信號放大核酸適配體傳感器。
【發明內容】
[0006] 為了解決目前AFBi檢測成本高、假陽性率高、檢測時間過長的缺點，本發明提供了 測定AFBj^信號放大核酸適配體傳感器，采用AFBi核酸酸適配體作為分子識別元件，絲網印 刷電極作為換能器，核酸外切酶作為信號放大工具。在本發明中，AFBi的出現能夠引發核酸 外切酶的酶切循環放大反應，產生較強的電化學信號放大效果。
[0007] 一種測定黃曲霉毒素也的信號放大核酸適配體傳感器，巰基修飾探針通過金-硫 鍵結合到絲網印刷電極的金電極上，AFBi核酸適配體通過結合到電極表面的巰基修飾探針 雜交，組裝到電極上，核酸外切酶在電極表面參與反應。
[0008] 所述巰基修飾探針為3 '端修飾有巰基，5 '端修飾有二茂鐵的巰基探針，其序列如 SEQIDN0:1所示;AFB1核酸適配體序列如SEQIDN0 :2所示。
[0009] 一種測定黃曲霉出的信號放大核酸適配體傳感器的制備方法，制備步驟如下：
[0010] (1)在絲網印刷電極的金電極表面滴加3yL含有ΙμΜ疏基修飾探針的1 X AFBi結合 緩沖溶液，于4°C下自組裝12h;然后，電極用1XBB溶液清洗3次以除去弱吸附的探針;隨后， 電極在ImM巰基乙醇溶液中室溫封閉30min;接著往電極表面滴加 ΙμΜ 1 X BB稀釋的六?81適 配體毒素溶液50此，于37°C下雜交2h，然后用1ΧΒΒ清洗3次后，將電極清洗干凈后于4°C吹 干，得到修飾好的電極；
[0011] (2)在修飾好的電極表面滴加50yL含有AFBjP核酸外切酶的1 X BB溶液，室溫反應 20min，用1 X BB清洗3次后即可進行差示脈沖電化學檢測。
[0012] 所述lXAFBi結合緩沖溶液與1XBB溶液相同，組分為10mM Hepes，120mM NaCl， 5mM KCl，5mM MgCl2，pH 7.0。
[0013] 一種測定黃曲霉也的信號放大核酸適配體傳感器作為檢測玉米中黃曲霉毒素也的 應用。本發明的有益效果在于：
[0014] (1)本發明采用AFBJS酸適配體作為分子識別元件，與基于抗體的免疫檢測技術 相比，具有非常好的特異性;同時，因核酸的合成成本非常低廉，且已經商業化，大大降低了 AFBi的檢測成本。
[0015] (2)本發明采用AFBi采用絲網印刷電極作換能器，采用核酸外切酶酶切循環放大 信號放大策略，具有結構簡單、加工簡便、成本低廉、便于批量制備、檢測靈敏度高等特點。
【附圖說明】
[0016] 圖1為測定黃曲霉毒素出的信號放大核酸適配體傳感器檢測原理圖；
[0017] 圖2為測定黃曲霉毒素 m的信號放大核酸適配體傳感器的現象圖；
[0018] 圖3為標準工作曲線及線性范圍。
【具體實施方式】
[0019] -種測定黃曲霉毒素仏的信號放大核酸適配體傳感器(如圖1所示），巰基修飾探 針通過金-硫鍵結合到絲網印刷電極的金電極上，AFBi核酸適配體通過結合到電極表面的 巰基修飾探針雜交組裝到電極上，核酸外切酶在電極表面參與反應，起信號放大的作用。
[0020] 所述探針為3端修飾有疏基，5端修飾有二茂鐵的疏基探針，其序列如SEQ ID NO:1所示;AFBi核酸適配體序列如SEQ ID NO:2所示。
[0021] -種測定黃曲霉出的信號放大核酸適配體傳感器的制備方法，制備步驟如下：
[0022] (1)在絲網印刷電極的金電極表面滴加3yL含有ΙμΜ巰基修飾探針的1 X AFBi結合 緩沖溶液，于4°C下自組裝12h;然后，電極用1XBB溶液清洗3次以除去弱吸附的探針;隨后， 電極在