一種大豆轉基因成分的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物檢測領域，特別涉及一種大豆轉基因成分的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 大豆是我國主要糧食作物，大豆轉基因技術已成熟，轉基因大豆品種的種植與推 廣需要嚴格審批，因此需要對轉基因大豆進行監管，轉基因成分檢測是轉基因監管的技術 支撐。
[0003] 現有的轉基因成分檢測技術主要檢測核酸或蛋白質，其中，基于核酸的檢測方法 主要流程為:提取待測樣品中的核酸，利用PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶鏈反應） 的方法擴增樣品中的轉基因成分，利用實時定量、瓊脂糖電泳或芯片技術檢測轉基因成分 是否存在。
[0004] 在實現本發明的過程中，發明人發現現有技術至少存在以下問題中的一種：
[0005] 轉基因成分多種多樣，而現有技術一次只能檢測其中一種或少數幾種，因此，需要 對可能的多種轉基因成份逐一進行檢測，才能確定為"非轉基因"產品；一般檢測的是共轉 化的轉基因成分，而不是外源基因本身，因此，對于無標記轉基因來說，現有技術會失效;檢 測基本上是定性檢測，但定量檢測又有其現實需求，例如，相鄰田塊的轉基因大豆品種的少 量花粉被傳到了非轉基因品種上，在定性檢測時，非轉基因品種將被誤判為轉基因品種而 不予審定或進行錯誤的行政處罰。
【發明內容】
[0006] 為了解決現有技術的問題，本發明實施例提供了一種大豆轉基因成分的檢測方 法。所述技術方案如下：
[0007] 本發明實施例提供了一種大豆轉基因成分的檢測方法，所述方法包括：
[0008] 確定待測樣品中需要檢測的轉基因成分、所述待測樣品中的內源標準基因和所述 待測樣品的外源標準基因，所述待測樣品為大豆植株或所述大豆植株的一部分；
[0009] 制備用于擴增所述轉基因成分、所述內源標準基因和所述外源標準基因的測試區 域的多重擴增引物；
[0010] 對所述待測樣品進行抽樣并混合，得到混合樣品；
[0011] 提取所述混合樣品的基因組；
[0012] 向所述混合樣品的基因組中加入所述外源標準基因，得到混合核酸；
[0013] 利用所述多重擴增引物對所述混合核酸進行擴增，得到擴增產物，利用所述擴增 產物構建高通量測序文庫；
[0014] 對所述高通量測序文庫進行高通量測序，得到測序片段組；
[0015] 分析所述測序片段組，獲得所述待測樣品中所述轉基因成分的測序片段的數量、 所述內源標準基因的測序片段的數量和所述外源標準基因的測序片段的數量；
[0016] 根據所述外源標準基因的測序片段的數量，判斷實驗是否成功；
[0017] 若所述實驗成功，則計算所述待測樣品種中所述轉基因成分的含量；
[0018] 根據所述轉基因成分的含量判斷所述待測樣品中是否含有轉基因成分。
[0019] 具體地，所述轉基因成分為外源功能基因、抗性標記基因、啟動子、終止子和外源 插入旁側序列中的至少一種。
[0020] 具體地，所述內源標準基因為所述待測樣品的基因組中的單拷貝基因。
[0021 ]具體地，所述外源標準基因不存在于所有生物中。
[0022] 具體地，所述判斷實驗是否成功的方法為：當所述外源標準基因的測序片段的數 量和所述內源標準基因的測序片段的數量均2 α?時，則實驗成功；當所述外源標準基因的 測序片段的數量或所述內源標準基因的測序片段的數量〈α?時，則實驗失敗;其中，α?為判 定閾值。
[0023] 具體地，所述判定所述待測樣品是否含有轉基因成分的方法為：當需要檢測的任 意一種所述轉基因成分的含量2 α2時，判定所述待測樣品含有轉基因成分；當所有所述轉 基因成分的含量<α2時，判定所述待測樣品不含有轉基因成分;其中，α2為判定閾值。
[0024] 具體地，計算所述待測樣品種中所述轉基因成分的含量的方法為:第m種所述轉基 因成分的含量的計算公式為
其中，i為所述第m種轉基因成分的 第i個測試區域，nl為所述第m種轉基因成分的所述測試區域的個數，bi為所述第m種轉基因 成分的第i個所述測試區域的所述測序片段的數量，k為第k種所述內源標準基因，n3為所述 內源標準基因的個數，j為第k種所述內源標準基因的第j個測試區域，n2為所述第k種內源 標準基因的所述測試區域的個數，aj為所述第k種內源標準基因的第j種所述測試區域的所 述測序片段的數量;N為所有所述內源標準基因的所述測試區域的總數。
[0025 ]具體地，所述外源標準基因的質量與所述混合樣品的基因組的總質量的比例大于 1/100000。
[0026] 本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是:本發明提供的檢測方法可以在 不同待測樣品、不同檢測的目標基因間通用，可以一次性檢測任意多種需要檢測的轉基因 成分，從而判定待測樣品是否含有轉基因成分，該方法可以實現定量檢測，且檢測結果幾乎 沒有下限，結果準確可靠，是現有技術達不到的。
【具體實施方式】
[0027] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施方式作進一 步地詳細描述。本發明實施例中未注明或詳細描述的操作流程或操作規范均為普通分子生 物學技術人員所熟知的操作。本發明實施例中未注明的試劑或生物材料均為市場上銷售的 常用試劑或生物材料，均為普通分子生物學技術人員所熟知的，且可以在市場上購買到。 [0028] 實施例
[0029] 通過農桿菌介導法將雙丙氨酰磷抗性(Biolaphos resistance，Bar)基因導入東 農42大豆品種，自交純化3代后，獲得改造的東農42大豆品種種子，作為本實施例的待測大 豆品種。其中，東農42大豆是轉基因大豆受體品種，由東北農業大學大豆研究所育成，本實 施例中使用的東農42大豆種子由江漢大學保存和繁殖。
[0030] 待測植物品種轉基因成分檢測方法，具體步驟如下：
[0031] 步驟1、確定待測樣品中需要檢測的轉基因成分、待測樣品中的內源標準基因和待 測樣品的外源標準基因，具體方法如下:待測樣品可以為大豆植株或大豆植株的一部分，其 中，大豆植株可以為大豆植株的根、莖、葉、花、果實和種子等器官，大豆植株的一部分可以 為大豆植株的根、莖、葉、花、果實和種子等器官中的一部分，也可以是2種及2種以上的不同 器官的混合物，如葉和莖的混合物。在本實施例中，待測樣品為改造后的東農42大豆的種 子，轉基因成分、內源標準基因和外源標準基因均2 1個，轉基因成分可以為外源功能基因、 抗性標記基因、啟動子、終止子和外源插入旁側序列中的至少一種，即通過轉基因技術手段 向東農42大豆品種中轉入不存在于東農42大豆品種中的外源核酸序列；內源標準基因為待 測樣品的基因組中的單拷貝基因。在本實施例中，內源標準基因通過NCBI (http:// WWW.ncbi .nlm.nih.gov/)在待測樣品基因組上比對時為單一序列；外源標準基因不存在于 所有生物中，在本實施例中，所使用的外源標準基因為ERCC04基因，其在NCBI上同源比對 時，未發現同源序列，可以判定外源標準基因不存在于所有生物中。在本實施例中，檢測的 轉基因成分共5種，內源標準基因1種，外源標準基因1種，其相關信息見表1，表1中所列轉基 因成分不僅包括Bar基因，其為外源功能基因，還包括其他轉基因成分，這些轉基因成分在 轉基因作物中廣泛使用，因此，本實施例提供的檢測方法具有通用性。表1中的基因序列有 兩種表示方式，一種是直接寫出基因序列，另一種是NBCI的基因編號，表1中的測序區域中 的數字代表堿基的位置，該基因的第1個堿基的位置定義為1。
[0032] 表1為實施例一中被檢測基因的相關信息與檢測結果
[0033]
[0034]
[0035] 表1中"/"表示無。
[0036] 步驟2、制備用于擴增轉基因成分、內源標準基因和外源標準基因的多重擴增引 物，具體方法如下：
[0037] 多重擴增引物的獲取過程如下：登錄賽默飛世爾公司多重PCR引物在線設計網頁 https ://ampl i