一種同時檢測異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲的pcr方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學檢測領域，具體涉及一種非疾病診斷目的同時檢測異育銀 鯽多種寄生粘孢子蟲的PCR方法。
【背景技術】
[0002] 粘孢子蟲(Myxosporeans)是一類世界分布的后生動物寄生蟲，屬于粘體動物門， 除少數種類寄生于兩棲類、爬行類、鳥類，甚至哺乳類外，大部分寄生于魚類，其中部分種類 能導致養殖魚類重大病害的發生，造成嚴重的經濟損失與生態污染。異育銀鯽是我國重要 的淡水經濟養殖魚類，近年來，隨著新品系的成功培育及養殖技術的推廣，其養殖規模不斷 擴大，但隨之而來的病害也日趨嚴重，病害問題已成為制約異育銀鯽產業健康發展的瓶頸 因素。
[0003] 洪湖碘泡蟲、武漢單極蟲、吳李碘泡蟲、丑陋圓形碘泡蟲是危害異育銀鯽養殖最為 嚴重的粘孢子蟲。洪湖碘泡蟲(Myxobolus honhuensis)是異育銀鯽"喉孢子蟲病"病原體， 主要危害異育銀鯽的苗種培育，其靶組織為魚體咽部，病害爆發后在咽部形成肉眼可見的 孢囊，魚體主要癥狀為不食、游動遲緩、咽部腫脹、鰓蓋外翻、眼球外凸、出血等，每年5-10月 為流行季節，5-7月為病害高發期，感染率可達60%，最高死亡率可達100%;武漢單極蟲 (Thelohanellus wuhanensis)是異育銀鯽"膚孢子蟲病"病原體，主要危害異育銀鯽的苗種 培育，能與洪湖碘泡蟲同期感染，其靶組織為魚體體表，在體表形成肉眼可見的小孢囊，使 魚體消瘦，畸形，生長緩慢，甚至大規模死亡，對苗種培育造成巨大的經濟損失;吳李碘泡蟲 (M.wulii)是"腹孢子蟲病"病原體，主要寄生于魚體的肝胰臟，形成肉眼可見的大孢囊，患 病魚表現為腹部膨大，內臟萎縮，肝胰臟組織結構被嚴重破壞，甚至被孢囊完全代替，最終 導致魚體的死亡;丑陋圓形碘泡蟲(M. turpisrotundus)主要寄生于異育銀鯽的鮑蓋、鮑弓、 口腔內外、鰭條等多個器官組織內，形成大小不一的肉眼可見孢囊，患病魚死亡率不高，但 嚴重影響商品魚的經濟價值。
[0004] 粘孢子蟲具有復雜的生活史，研究表明粘孢子蟲在魚體中的發育一般要經過營養 體和成熟孢子(孢囊)階段。在我國，粘孢子蟲病的檢測主要以顯微鏡下可見成熟孢子、肉眼 可見孢囊為依據，而一旦粘孢子蟲在魚體內形成成熟的孢子或孢囊，沒有任何有效藥物能 夠滲入成熟孢子堅硬的幾丁質外殼。因此，有必要建立一種簡單快速的早期檢測方法，在粘 孢子蟲的營養體階段進行藥物防治，有效地防控粘孢子蟲病的病害。
[0005] 在粘孢子蟲的檢測方面，以顯微鏡觀察成熟孢子為基礎的形態學檢測方法，雖然 操作簡便，但存在檢測滯后、費時費力、效率低、易于漏檢等問題；以抗原與抗體反應為基礎 的免疫學檢測方法，雖然具有靈敏性高、能進行早期檢測的特點，但由于粘孢子蟲生活史中 存在期、屬特異性抗原以及共同抗原，交叉反應嚴重，增加了種特異性檢測的難度；以PCR技 術為基礎的分子生物學檢測方法具有較高的特異性與靈敏性，已經被廣泛運用于寄生蟲的 早期檢測中。
[0006] 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR基礎上加以改進，于一個PCR反應體系中加 入多對特異性引物，針對多個模板或同一模板的不同區域擴增多個目的片段的PCR技術，可 用于同時檢測多種病原體。該方法不僅能早期檢測，靈敏性高，特異性強，而且同普通PCR方 法相比具有省時省力、簡單快速等優點。目前，國內外尚無同時對異育銀鯽寄生的多種粘孢 子蟲進行早期檢測的報道。
【發明內容】
[0007] 鑒于異育銀鯽寄生粘孢子蟲早期檢測方法的缺乏，本發明提供一種同時檢測四種 寄生于異育銀鯽的粘孢子蟲的PCR方法，該方法靈敏性高，特異性強，操作簡單，有利于異育 銀鯽的養殖，能夠產生顯著的經濟效益。
[0008] 上述目的是通過以下技術方案實現的：
[0009] -種非疾病診斷目的同時檢測異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲的PCR方法，包括以下 步驟：
[0010] (l)DNA提取:剪取異育銀鯽皮膚、鰓、咽及肝胰臟四個部位的部分組織，混合后置 于研缽中，剪碎并加入液氮充分研磨，然后提取組織樣品DNA;
[0011] (1)特異性DNA片段擴增：分別以丑陋圓形碘泡蟲的18S rRNA、吳李碘泡蟲與洪湖 碘泡蟲的ITS1-5.8S-ITS2、武漢單極蟲的28S rRNA基因為分子靶標，各設計一對特異性引 物，分別命名為Mtl8S F/R、MwITS F/R、MhITS F/R、Tw28S F/R;將四對引物置于單個PCR反 應體系中，同時擴增四種粘孢子蟲的特異性基因片段；
[0012] (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據PCR擴增產物的片段大小進行結果判定，其中：擴增 出894bp條帶的是丑陋圓形碘泡蟲，590bp的是吳李碘泡蟲，447bp的是洪湖碘泡蟲，245bp的 是武漢單極蟲，
[0013]所述的四對特異性引物序列分別為：
[0014] Mtl8S F:5'-ACCAGATATTTCGAGGAGTCGTTG-3'
[0015] Mtl8S R:5'-TTCCACAACGTTGCTATATAGCCA-3'
[0016] MwITS F:5'-GCCGTACATGAATTGAGGCTTGAC-3'
[0017] MwITS R:5'-TGCTCACAACGTTAACTCGAACC-3'
[0018] MhITS F:5'-ACGACCAATATATGAAATTGTTTCTCGA-3'
[0019] MhITS R:5'-TTCATTCGTAAAAATGACCTCTACTTTATAC-3'
[0020] Tw28S F:5'-TTTGTAAAATTCTTAACGCTGGCTAA-3'
[0021] Tw28S R:5 '-TCGAAACGCCAAAACTACGTCA-3 '。
[0022] 優選地，步驟(2)中的PCR反應體系為：
[0023] DNA擴增模板2yL、10XPCR Buffer 2.5yL、25mM Mg2+3.0yL、2.5mM dNTPs4yL、5UAi L TaqDNA聚合酶0.2yL，Mtl8S F/R各0.8yL、MwITS F/R各0.4yL、MhITS F/R各0.6yL、Tw28S F/R各0.4yL，滅菌 ddH20補足至 25yL。
[0024] 優選地，步驟（2)中的PCR反應條件為：95°C預變性5min，94°C變性30s，58°C退火 30s，72°C 延伸 7〇8,35個循環；72°(：延伸71^11，4°(：保存。
[0025] 本發明的有益效果在于：
[0026] 本發明以粘孢子蟲的183以祖、1了31-5.83-1了32及283冰熟基因為分子靶標，具 有較高的特異性與靈敏性，三種分子靶標各具特點，其中18S rRNA基因序列長度適中、信息 充足，運用最為廣泛；28S rRNA基因片段長，包含相對較多的變量，適合用于不同階元的分 析研究；ITS屬于非編碼序列，中間被5.8S rRNA基因分開，進化速度快，具有可變性，尤其適 用于同屬近緣物種的區別和鑒定。
[0027]本發明方法特異性強，靈敏性高，可以檢測粘孢子蟲的早期階段；同時，與普通PCR 檢測方法相比，能夠在單個PCR管中進行一次反應檢測丑陋圓形碘泡蟲、吳李碘泡蟲、洪湖 碘泡蟲與武漢單極蟲，省時省力，具有較大的經濟效益。
【附圖說明】
[0028]圖1:四對引物平衡濃度的實驗結果。圖中的電泳帶分別為:M:Marker DL2000; 1 -12分別代表反應體系中四對引物的添加濃度：1:0.8、0.8、0.4、0.4μΜ2:0.8、0.4、0.6、0.4μ L;3:0.8、0.4、0.4、0.6yL;4:0.6、0.8、0.4、0.4yL ;5:0.4、0.8、0.6、0.4yL;6:0.4、0.8、0.4、 0.6yL;7:0.6、0.4、0.8、0.4yL;8:0.4、0.6、0.8、0.4yL ;9:0.4、0.4、0.8、0.6yL;10:0.6、0.4、 0.4、0.841^11:0.4、0.6、0.4、0.841^12:0.4、0.4、0.6、0.84以各引物工作濃度均為1(^]\1 ;每 組從左至右分別為:Mtl8S F/R、MwITS F/R、MhITS F/R、Tw28S F/R);l-12均以四種粘孢子 蟲混合DNA為模板。
[0029]圖2 : Mg2 +、dNTP、TaqDNA聚合酶平衡濃度的實驗結果。圖中的電泳帶分別為：Μ: Marker DL2000; 1:2.0、2.0、0.2yL;2:3.0、2·0、0·3μΜ3:4·0、2·0、0·4μΜ4:2·0、3·0、0·3μ L;5:3.0、3.0、0.4uL;6:4·0、3·0、0·2uL;7:2·0、4·0、0·4uL;8:3·0、4·0、0·2uL;9:4·0、4·0、 0·3μLΧ 每組從左至右分別是 Mg2+(25mM)、dNTPs(2.5mM)、TaqDNA 聚合酶（5UAiL));l-9 均以四 種粘孢子蟲混合DNA為模板。
[0030] 圖3:不同反應退火溫度的實驗結果。圖中的電泳帶分別為:M:Marker DL2000;l-6 分別代表反應退火溫度為55、56、57、58、59、60 °C ; 7:空白對照。
[0031]圖4:四重PCR特異性實驗結果。a:丑陋圓形碘泡蟲;b:吳李碘泡蟲;c:洪湖碘泡蟲； d:武漢單極蟲。圖中的電泳帶分別為:M: Marker DL2000 ;l:a，b，c，d;2:a，b，c;3:a，b，d;4: 13，(：，(1;5:&，13;6:&，(3;7:&，(1;8:13，(3;9:13，(1;10:(3，(1混合0祖；11:&;12:13;13:(3;14:(