炭疽芽孢桿菌熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種采用實時熒光PCR方法特異性檢測樣品中炭疽芽孢桿菌核酸的試 劑盒，屬于炭疽芽孢桿菌的體外診斷領域。
[0002]
【背景技術】
[0003] 炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)是有傳染性的動物源性細菌，引起動物和人 類炭疽的病原菌，主要感染牛和羊等食草動物，人可以通過接觸或食用患病動物及畜產品 而感染。
[0004] 根據傳播途徑的不同，人類炭疽可分為三型。第一型為皮膚炭疽(最多見），因接觸 患病動物及受染皮毛而感染；病菌從皮膚傷口進入體內并在局部引起炎癥，出現水皰、膿 皰，最后形成壞死、潰瘍，中心有黑色壞死性焦痂，故名炭疽。第二型腸炭疽，多由食入未煮 熟的病畜肉而感染，以惡心、嘔吐、厭食在先，繼以發熱、腹痛、頻繁腹瀉及血便，發病后2-3 天可因毒血癥而死亡，病死率達25%_60%。第三型肺炭疽，多因處理病畜皮毛時吸入病菌芽 孢，在肺組織局部發芽繁殖，引起呼吸道癥狀及原發性肺炎，并伴發全身中毒癥狀。各型炭 疽均能并發敗血癥，以傳染性休克為特征，心肺功能迅速衰竭而致死。敗血癥型炭疽亦可引 起出血性腦膜炎，患者出現嘔吐、驚厥、高熱、昏迷和腦膜炎刺激征，腦脊液呈血性或膿性， 繼發多器官衰竭，多在第2-4天死亡，病死率100%。
[0005] 在檢測中，PCR法由于其快速簡便的特點逐漸呈現出要替代以細菌培養和血清學 檢測為主的傳統檢測方法的趨勢。而對于PCR方法來說，引物的特異性是其檢測的特異性和 敏感性的基礎。
[0006] 本發明分別針對炭疽芽孢桿菌毒力島基因序列的保守區域特異的靶序列設計引 物和Taqman探針，利用real-time PCR的方法，用來快速檢測樣品中是否存在炭疽芽孢桿菌 的核酸。
【發明內容】
[0007] 本發明主要解決的技術問題是快速準確地檢測樣品中是否存在炭疽芽孢桿菌，提 供一種特異性檢測炭疽芽孢桿菌的熒光PCR試劑盒。
[0008] 本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的： 一種特異性檢測樣品中炭疽芽孢桿菌核酸的試劑盒，組分包括PCR反應液、酶混合液、 陰性質控品和陽性質控品。其中PCR反應液主要含有上述的引物和探針、反應緩沖液、Mg2+和 dNTP等，酶混合液主要含有熱啟動Taq酶，陰性質控品為無 RNase和DNase水，陽性質控品為 含炭疽芽孢桿菌特異性擴增位點的重組質粒。
[0009] PCR反應液中用于核酸擴增的引物為P1和P2，P1和P2為針對炭疽芽孢桿菌基因組 群特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物;PCR反應液中用于熒光信號監測 的寡核苷酸探針為ProbeUProbel為針對炭疽芽孢桿菌基因組群特異性保守序列設計并經 預實驗篩選出的特異性探針，其中熒光報告基團Χι為FAM，熒光淬滅基團YiSEclipse(見表 1)〇
[0010] 表1檢測炭疽芽孢桿菌的引物和探針序列
本發明的另一個目的是提供本熒光PCR檢測試劑盒在檢測炭疽芽孢桿菌的應用方法， 包括： 試劑盒選用的PCR反應體系為20 μL，包括2XPCR緩沖液10 yUlOmmol/L dNTP 1.0 μ 1、25_〇1/1引物各0.5 yUlOymol/L探針0.2 μL、熱啟動Taq酶混合液0.4 μL、樣品DNA 2 μL，加滅菌水至終體系20 μL。
[0011] 試劑盒的PCR反應循環參數為94°C，2min;進入循環階段:94°C變性10s，56°C退火 50s，72 °C延伸15s，共反應40個循環。
[0012] 質量控制:每次實驗應設立陰、陽性對照，陰性對照無 Ct值(或Ct值為0)，陽性對照 Ct值< 30，否則實驗結果不成立。
[0013]結果判讀： 陽性：出現"S"型擴增曲線，Ct值< 35;可疑：出現"S"型擴增曲線，但Ct值> 35;陰性:沒 有出現"S"型擴增曲線，或者曲線雖然超過了閾值，但不呈"S"型;對可疑結果，應重復實驗， 如果重復實驗還是出現"S"型擴增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性。
[0014] 樣本要求:采集皮膚炭疽的膿液、滲出物，肺炭疽的咯痰，腸炭疽的糞便以及病人 的的血液，疑似生物恐怖襲擊的不明來源白色粉末；白色粉末可以室溫運輸，其余樣本采集 后應帶冰運輸;標本應-20°C保存，不能反復凍融;從臨床樣本提取DNA，建議采用性能穩定 可靠的商品化試劑盒，具體方法參見相應商品化試劑盒說明書，提取的DNA應立即檢測，否 貝丨J，應將DNA分裝后-80°C~-20°C保存。
[0015] 本發明提供的試劑盒具有很好的特異性，可以檢出炭疽芽孢桿菌，但不能檢出非 炭疽芽孢桿菌病原體的核酸;對炭疽芽孢桿菌核酸的檢測下限為10拷貝每反應體系；只需 要2小時即可完成檢測，可為炭疽芽孢桿菌的疾病監測和臨床診斷提供實驗依據。
【附圖說明】
[0016] 圖1為單重實時熒光PCR檢測炭疽芽孢桿菌陽性標準品的擴增曲線圖。從左至右的 每組曲線對應濃度依次為2 X 106-2 X 102c〇piesAU，試劑盒對炭疽芽孢桿菌的檢測限均為 10拷貝每反應體系。橫坐標為反應循環數，縱坐標為不同循環數熒光檢測信號的A Rn值。 [00Π ]圖2為單重實時熒光PCR檢測體系檢測10種細菌基因組DNA的擴增曲線圖。10種細 菌包括:炭疽芽孢桿菌和9種陰性對照微生物。炭疽芽孢桿菌出現S型擴增曲線，而其他9種 病原微生物未出現S型擴增曲線。
【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例詳細說明本發明的優選實施方式。需要指出的是，這里列出 的實施例僅僅為示例性說明的目的，而不應將其解釋為對本發明范圍的任何限制。其中使 用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實施例中具體選擇的試劑，應理解，本領域技術人 員可根據需要選擇其他公司的相應試劑以實現本發明的目的。
[0019]、引物和TaqMan探針的設計與合成 利用Biast工具對Genbank和國內外文獻中的炭疽芽孢桿菌基因組序列進行分析，分別 選擇其穩定的保守區域作為檢測靶序列。炭疽芽孢桿菌檢測靶序列為質粒PX01基因；并針 對檢測靶序列設計和合成引物和探針（見表1)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公 司合成，炭疽芽孢桿菌的檢測探針5 '端標記FAM熒光基團，3 '端標記Eel ipse熒光淬滅基團。
[0020] 、檢測菌種的準備 本實施例中所使用的炭疽芽孢桿菌以及其他陰性對照菌株(馬耳他布魯菌，鼠疫耶爾 森菌，小腸結腸炎耶爾森菌，土拉弗朗西斯菌，肺炎克雷伯菌，大腸桿菌，大腸埃希菌，流感 嗜血桿菌，嗜肺軍團菌)均購買于中國藥品生物制品檢定所。